El aislamiento de células madre de cáncer de páncreas xenoinjertos

1. Xenoinjertos de la cosecha de los ratones Prepare la disociación celular de amortiguación: Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FCS), penicilina-estreptomicina, 200 U / ml de colagenasa tipo IV, y el 0,6 dispasa U / mL. Un atímicos (nu + / nu +) ratón albergar una inyección subcutánea humanos xenoinjertos de cáncer de páncreas que es menos de 1 cm de diámetro mayor es la eutanasia por asfixia de dióxido de carbono y la dislocación cervical. El tumor se extrae por vía subcutánea en el flanco del ratón mediante disección roma con unas pinzas y tijeras y se coloca inmediatamente en el buffer de disociación celular. Los tumores se pesan y se coloca de nuevo en 10 ml de células buffer de disociación por 1 gramo de tejido del tumor. 2. Generar una única suspensión de células a partir de los xenoinjertos Trabajo en un recipiente estéril de cabinas de seguridad, el tumor se transfiere a un 100 x 20 mm placa de cultivo con 1 ml de células buffer de disociación. Los tumores son mecánicamente picada con cuchillas de afeitar y pinzas estériles. La suspensión de las células tumorales se tritura a través de una pipeta serológica de 5 ml de 10 veces. Las piezas del tumor debe ser lo suficientemente pequeño como para no obstruir la pipeta serológica de 5 ml. La suspensión de las células tumorales se transfiere a un tubo cónico de 50 ml que contiene el volumen restante de disociación celular de amortiguación (llena de menos del 50%) y vortex a máxima velocidad durante 1 minuto. La suspensión de las células tumorales se incuba a 37 ° C durante 2 horas con agitación intermitente durante 1 minuto cada 20 minutos. 3. Agotan la suspensión de células de restos de tejido y las células muertas Después de la incubación de 2 horas la suspensión celular se agita a la máxima velocidad durante 1 minuto. La suspensión celular se hace pasar por un filtro de 70 micras, y se recoge en un nuevo máximo de 50 ml tubo cónico y ajustado a un volumen final de 15 ml por tubo. A fin de separar las células viables de las células muertas y restos de tejido, la suspensión de las células tumorales se separa por centrifugación de densidad con Ficoll-Paque Plus. Una capa de base de Ficoll-Paque Plus es creado por pipeta 15 ml de Ficoll-Paque Plus lentamente por debajo de la suspensión celular con cuidado de no mezclar las dos capas. La suspensión de células y capas de Ficoll se se centrifuga a 500x g durante 30 minutos con el freno desactivado. Las células en la interfase del Plus Ficoll-Paque y el tampón disociación celular se recogen y se transfieren a un nuevo máximo de 50 ml tubo cónico. DMEM suplementado con 10% FCS, se añade a la suspensión celular para diluirla 1:3 (por ejemplo, 20 ml de medio fresco a 10 ml de suspensión celular). Las células se recogieron por centrifugación a 450x g durante 10 minutos, los medios de decantación y el pellet de células se resuspende en 1 ml de solución tampón ALDEFLUOR. Diez microlitros de la suspensión celular se diluye con 10 l azul tripano y las células viables se contaron usando un hemocitómetro. Si un gran número de células muertas o restos de tejido se observó durante este paso, entonces la separación de células por centrifugación de densidad se puede repetir (pasos 3,3 hasta 3,7). 4. Tinción de las células de clasificación celular activado por fluorescencia Etiqueta de siete de 12 x 75 mm tubos de ensayo de poliestireno de la siguiente manera: Sin mancha CD44-APC CD24-PE ratón CD31-biotina + ratón linaje-biotina + ratón H-biotina-2Kd ALDEFLUOR ALDEFLUOR + + IgG DEAB 2bκ-APC + IgG 2aκ-PE ALDEFLUOR + CD44 + CD24-APC-PE + ratón + CD31-biotina ratón linaje-biotina + ratón H-2Kd-biotina. Diluir la suspensión de células en 2 ml de solución tampón ALDEFLUOR a una concentración final de 5-10 millones de células / ml y mantener en hielo. Añadir 100 ml de la suspensión celular a los tubos 1, 2, 3 y 4 y mantener en hielo. Añadir un DEAB l de tubo n º 6 y mantener en hielo. Añadir el reactivo ALDEFLUOR a la suspensión celular diluida restante 1000 – veces (por ejemplo, añadir 1,6 l de reactivo ALDEFLUOR a 1,6 ml de suspensión celular), mezclar bien y colocar en hielo. Transferencia de 100 l de esta mezcla en los tubos # 5 y 6, y el resto de la mezcla (1,4 ml) al tubo # 7. Incubar todos los tubos en un baño de agua 37 ° C durante 40 minutos. Mezcle la suspensión de células cada 10 minutos con el fin de evitar que las células se depositen en el fondo de los tubos. Centrifugar las células a 450x g y 4 ° C durante 10 minutos y luego decantar el buffer. Volver a suspender las pastillas en tubos de 1 y 5 de cada 100 l de amortiguación ALDEFLUOR. A los tubos # 2, 3, 4 y 6, añadir 100 ml de solución tampón ALDEFLUOR que contiene los anticuerpos adecuados diluido de la siguiente manera: 1:20 de la IgG 2bΚ-APC, IgG 2aΚ-PE, CD44-APC, y CD24-PEanticuerpos; 1:100 para el ratón CD31-biotina, el ratón linaje-biotina, y el ratón H-biotina-2Kd anticuerpos. Al tubo # 7 añadir 1,4 ml de solución tampón que contiene ALDEFLUOR una dilución 1:20 de CD44-APC, y los anticuerpos CD24-PE y una dilución de 1:100 de ratón CD31-biotina, el ratón linaje-biotina, y el ratón H-biotina-2Kd anticuerpos. Se incuban las células en suspensión en hielo durante 10 minutos. Centrifugar las células a 450x g y 4 ° C durante 10 minutos y luego decantar el buffer. Volver a suspender las pastillas en tubos de 1, 2, 3, 5 y 6 de cada 100 l de amortiguación ALDEFLUOR. Preparar 1.5 mL de tampón ALDEFLUOR que contiene una dilución 1:100 de estreptavidina-PerCP proteínas. Añadir 100 ml de tubo n º 4 y añadir 1,4 ml al tubo # 7. Se incuban las células en suspensión en hielo durante 10 minutos. Centrifugar las células a 450x g y 4 ° C durante 10 minutos y luego decantar el buffer. Volver a suspender las pastillas en tubos de 1, 2, 3, 4, 5 y 6 de cada 200 l de amortiguación ALDEFLUOR. Resuspender el precipitado en el tubo # 7 en 2,8 ml de solución tampón que contiene ALDEFLUOR 2 mg / ml de yoduro de propidio. Mantenga los tubos en hielo en todo momento. Pasar las células a través de 35 micras filtro con 12 x 75 mm tubos de ensayo de poliestireno con tapas de filtro. 5. Aislar células madre del cáncer de clasificación celular activado por fluorescencia Un citómetro de flujo FACSAria se prepara para la clasificación de la célula. Controles de compensación se establecen con las células de los tubos 1, 2, 3, 4 y 5. Gates se crean sobre la base de proyecciones y los parámetros de dispersión lateral para recoger células de tirantes. No-ratón (PerCP-negativo) y células viables (no teñidas de propidio yoduro) son cerradas mediante el canal FL-3. ALDH + células se obtienen sobre la base de las puertas creadas con DEAB las células tratadas (tubo n º 6) y el canal FL-1. CD44 + CD24 + células se obtienen sobre la base de las puertas creadas con células teñidas con ALDEFLUOR, IgG 2bΚ-APC, y la IgG 2aκ-PE (tubo n º 6) con el FL-4 y los canales de FL-2. Las células se recolectan en 12 x 75 mm tubos de ensayo de poliestireno que contiene 1 ml de DMEM suplementado con 10% FCS. Después las células han sido ordenados, centrifugar la suspensión celular a 450x g durante 10 minutos, decantar los medios de comunicación, y volver a suspender las células en 500 l DMEM suplementado con 10% FCS. Cuente el número de células seleccionadas utilizando un hemocitómetro como se describe en el paso 3.8. 6. Resultados representante Este protocolo conducirá al aislamiento de ALDH + y CD44 + CD24 + de páncreas células madre cancerosas. El porcentaje de células derivadas de ratón es variable, pero hemos encontrado que la mayoría de los xenoinjertos de cáncer humano de páncreas contienen un 20-60% de las células derivadas de ratón con el ratón CD31, cóctel de ratón linaje, y el ratón H-biotina 2Kd anticuerpos conjugados (Figura 1 ). Asimismo, la frecuencia de cada población CSC de xenoinjertos diferentes es variable, pero en general hemos encontrado que 4.1% de la población total de células ALDH es + (fig. 1B) y 0,2-5% es CD44 + CD24 + (fig. 1C). En forma rutinaria manual recuento de células ordenados utilizando un hemocitómetro desde la máquina cuenta FACSAria son a menudo inexactas debido a la no-celular partículas detectadas por el FACSAria. Figura 1. Trama de citometría de flujo que representa la población específica de un xenoinjerto de cáncer de páncreas. (A) Las células de tinción positiva en el canal FL-3 (yoduro de propidio +, CD31 + ratón + linaje de ratón o mouse H-2Kd +) están excluidos a fin de aislar sólo viables y no las células derivadas de ratones. (B) la actividad de la ALDH en un xenoinjerto de cáncer de páncreas humanos se midió por citometría de flujo utilizando el reactivo ALDEFLUOR en presencia y ausencia del inhibidor ALDH1 dietilamino-benzaldehído (DEAB). Los cuadros representan las puertas que representan las células ALDH + que se han creado sobre la base de las células tratadas con DEAB y luego se aplican a las células no tratadas. Los porcentajes de células + ALDH se muestran en la puerta. (C) El CD44 + CD24 + puerta fue creado a partir de células teñidas con ALDEFLUOR, y los anticuerpos IgG 2bκ-APC (control isotípico de CD44-APC) y la IgG 2aκ-PE (control isotípico de CD24-PE). Los porcentajes de células CD44 + CD24 + se muestran en la puerta.