Isolamento de células-tronco de xenoenxertos Humano do Câncer de pâncreas

1. Xenoenxertos colheita de Ratos Prepare a célula de dissociação buffer: Dulbecco modificado Eagle (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FCS), a penicilina-estreptomicina, 200 U / mL de colagenase tipo IV, e 0,6 dispase U / mL. Um atímicos (nu + / nu +) do mouse abrigar um subcutânea xenoenxerto de câncer humano de pâncreas que é menos de 1 cm de maior diâmetro é sacrificados por asfixia de dióxido de carbono e deslocamento cervical. O tumor é colhida subcutâneo do flanco do mouse por dissecção romba usando uma pinça e tesouras e colocado imediatamente no buffer de células dissociação. Tumores são pesados ​​e colocados de volta em 10 mL de células dissociação tampão por 1 grama de tecido do tumor. 2. Gerar uma suspensão de células isoladas da xenoenxertos Trabalhando em um estéril biossegurança gabinete, o tumor é transferido para uma placa de cultura 100 x 20 mm com 1 mL de tampão de células dissociação. Tumores são mecanicamente picada usando lâminas de barbear estéreis e fórceps. A suspensão de células tumorais é triturado através de uma pipeta de 5 mL sorológicos 10 vezes. As peças tumor deve ser pequeno o suficiente para não entupir a pipeta de 5 mL sorológicos. A suspensão de células tumorais é transferido para um tubo cônico de 50 mL contendo o volume restante de células dissociação buffer (cheio menos de 50%) e centrifugadas a uma velocidade máxima por 1 minuto. A suspensão de células tumorais é, então, incubados a 37 ° C por 2 horas com vórtex intermitente por 1 minuto a cada 20 minutos. 3. Destroem suspensão de células de restos de tecido e células mortas Após a incubação de 2 horas da suspensão de células é agitadas na velocidade máxima durante 1 minuto. A suspensão de células é então passado através de um filtro de 70 mm e coletado em um tubo de 50 mL fresco cônica e ajustado para um volume final de 15 mL por tubo. Para separar ainda mais células viáveis ​​a partir de células mortas e restos de tecido, a suspensão de células tumorais é separado por centrifugação de densidade Ficoll-Paque Plus. Um underlayment de Ficoll-Paque Plus é criado por pipetar 15 mL de Ficoll-Paque Plus lentamente abaixo da suspensão de células com cuidado para não misturar as duas camadas. A suspensão de células e camadas de Ficoll estão é centrifugado a 500x g por 30 minutos com os freios desligado. Células na interface de o Plus Ficoll-Paque e buffer de células dissociação são coletados e transferidos para um tubo de 50 mL fresco cônico. Frescos DMEM suplementado com 10% SFB é adicionado à suspensão de células para o diluir 1:3 (por exemplo, 20 mL de mídia fresco adicionado a 10 mL de suspensão de células). As células são coletadas por centrifugação a 450X g por 10 minutos, a mídia decantado, eo pellet celular é ressuspenso em 1 mL de tampão ALDEFLUOR. Dez microlitros da suspensão de células é diluído com 10 mL de tripan azul e células viáveis ​​são contadas usando um hemocitômetro. Se um grande número de células mortas ou restos de tecido são anotados durante esta etapa, a separação das células por centrifugação de densidade podem ser repetidos (passos 3,3-3,7). 4. Células mancha para separação de células de fluorescência Activated Rótulo sete 12 x 75 mm tubos de poliestireno teste da seguinte forma: Imaculado CD44-APC CD24-PE rato CD31-biotina + mouse linhagem-biotina + mouse H-2Kd-biotina ALDEFLUOR ALDEFLUOR + + deab IgG 2bκ-APC + IgG 2aκ-PE ALDEFLUOR + CD44 + CD24-APC-PE + mouse CD31-biotina + mouse linhagem-biotina + mouse H-2Kd-biotina. Diluir a suspensão de células em 2 mL de tampão ALDEFLUOR para uma concentração final de 5-10 milhões de células / mL e manter em gelo. Adicionar 100 mL da suspensão de células de tubos # 1, 2, 3 e 4 e mantê-los no gelo. Adicionar 1 mL para tubo de deab # 6 e manter em gelo. Adicionar reagente ALDEFLUOR à suspensão de células restantes diluídas 1000 – fold (por exemplo, adicionar 1,6 mL de reagente ALDEFLUOR para 1,6 mL suspensão celular), misturar bem e colocar no gelo. Transferir 100 mL dessa mistura para tubos de # 5 e 6, ea mistura restante (1,4 mL) ao tubo n º 7. Incubar todos os tubos em banho-maria a 37 ° C por 40 minutos. Misture a suspensão celular a cada 10 minutos a fim de impedir as células de sedimentação para o fundo dos tubos. Centrifugar as células a 450X g e 4 ° C por 10 minutos e decantar o buffer. Volte a suspender as pelotas em tubos de # 1 e 5 em cada 100 mL de buffer ALDEFLUOR. Para tubos # 2, 3, 4 e 6, adicionar 100 mL de ALDEFLUOR buffer que contém os anticorpos adequados diluído da seguinte forma: 1:20 para IgG 2bΚ-APC, IgG 2aΚ-PE, CD44-APC, e CD24-PEanticorpos; 1:100 para mouse CD31-biotina, mouse linhagem-biotina e mouse H-2Kd-biotina anticorpos. Ao tubo # 7 adicionar 1,4 mL de tampão contendo ALDEFLUOR uma diluição 1:20 do CD44-APC, e CD24-PE anticorpos e uma diluição de 1:100 do mouse CD31-biotina, mouse linhagem-biotina e mouse H-2Kd-biotina anticorpos. Incubar as suspensões de células no gelo por 10 minutos. Centrifugar as células a 450X g e 4 ° C por 10 minutos e decantar o buffer. Volte a suspender as pelotas em tubos de # 1, 2, 3, 5, e 6 em 100 mL de buffer ALDEFLUOR. Prepare 1,5 mL de tampão contendo ALDEFLUOR uma diluição de 1:100 de estreptavidina-PerCP proteína. Adicionar 100 mL para o tubo n º 4 e adicionar 1,4 mL para tubo de # 7. Incubar as suspensões de células no gelo por 10 minutos. Centrifugar as células a 450X g e 4 ° C por 10 minutos e decantar o buffer. Volte a suspender as pelotas em tubos de # 1, 2, 3, 4, 5 e 6 em 200 mL de buffer ALDEFLUOR. Ressuspender o sedimento em tubo de 7 em 2,8 mL de tampão contendo 2 ALDEFLUOR mcg / mL de iodeto de propídio. Mantenha os tubos no gelo em todos os momentos. Passe as células através de 35 mícrons filtro com 12 x 75 mm tubos de ensaio com tampas de poliestireno filtro. 5. Isolar células-tronco cancerosas por separação de células de fluorescência Activated Um citômetro de fluxo FACSAria está preparado para separação de células. Controles de compensação são definidas usando as células dos tubos n º 1, 2, 3, 4 e 5. Portões são criados com base em declarações de lado e dispersão de parâmetros para coletar singlets celular. Mouse-sem (PerCP-negativos) e viáveis ​​(não coradas propidium iodeto), as células são fechadas através do canal de FL-3. Células ALDH + são coletados com base em portas criado usando deab células tratadas (tubo # 6) e do canal-1 FL. CD44 + CD24 + células são coletadas com base em portas criado usando células coradas com ALDEFLUOR, IgG 2bΚ-APC, e IgG 2aκ-PE (tubo # 6) usando o FL-4 e FL-2 canais. As células são coletadas em 12 x 75 mm tubos de ensaio contendo poliestireno 1 mL de DMEM suplementado com 10% SFB. Depois que as células foram ordenadas, centrifugar a suspensão de células em 450X g por 10 minutos, decantar a mídia, e ressuspender as células em 500 mL DMEM fresco suplementado com 10% SFB. Contar o número de células classificadas utilizando um hemocitômetro como descrito no passo 3.8. 6. Resultados representante Este protocolo vai levar ao isolamento da ALDH + e CD44 + CD24 + CSCs pancreático. A porcentagem de células derivadas do mouse é variável, mas descobrimos que xenoenxerto de câncer pancreático mais humano contêm 20-60% de células de rato derivados usando o mouse CD31, mouse cocktail linhagem, e mouse H-2Kd biotina anticorpos conjugados (Figura 1A ). Da mesma forma a freqüência de cada população CSC de xenoenxertos diferentes é variável, mas geralmente descobrimos que 1-4% da população total de células é ALDH + (Figura 1B) e 0,2-5% é CD44 + CD24 + (Figura 1C). Rotineiramente manualmente contagem de células classificados usando um hemocitômetro desde a máquina de contagem de FACSAria são muitas vezes imprecisas devido à não-celular partículas detectadas pelo FACSAria. Figura 1. Enredo citometria de fluxo retratando populações específicas de um xenoenxerto de câncer pancreático. (A) Células coradas positivamente no canal de FL-3 (propidium iodeto +, mouse CD31 + + lineage mouse, ou mouse H-2Kd +) são excluídos de forma a isolar apenas viáveis ​​e não do rato células derivadas. (B) ALDH atividade em um xenoenxerto de câncer pancreático humano foi medido por citometria de fluxo usando o reagente ALDEFLUOR na presença e ausência do inibidor ALDH1 dietilamino-benzaldeído (deab). Os quadros representam portões que retratam células + ALDH que foram criadas com base em células tratadas com deab e depois aplicada a células não tratadas. As porcentagens de células + ALDH são mostrados no portão. (C) O CD44 + CD24 + portão foi criado a partir de células coradas com ALDEFLUOR, eo IgG 2bκ-APC (controle isotípico para CD44-APC) e IgG 2aκ-PE (controle isotípico para CD24-PE) anticorpos. As porcentagens de células CD44 + CD24 + são mostrados no portão.