Isolamento di cellule staminali da xenotrapianti di cancro pancreatico umano

1. Xenotrapianti raccolta da topi Preparare la cellula dissociazione buffer: Dulbecco modificato (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FCS), la penicillina-streptomicina, 200 U / mL Collagenasi tipo IV, e 0,6 U / mL dispasi. Un atimici (+ nu / nu +) topo ospitare un essere umano per via sottocutanea xenotrapianto cancro al pancreas che è meno di 1 cm di diametro è eutanasia per asfissia anidride carbonica e dislocazione cervicale. Il tumore sottocutaneo viene raccolto dal fianco del mouse per via smussa con pinze e forbici e collocato immediatamente nel buffer cellula dissociazione. I tumori sono pesati e posti di nuovo in 10 ml di cellule dissociazione tampone per 1 grammo di tessuto tumorale. 2. Generare una singola cella di sospensione dal xenotrapianti Lavorare in un armadio sterile biosicurezza, il tumore viene trasferito in un piatto x 100 20 mm con la cultura 1 ml di tampone delle cellule dissociazione. I tumori sono meccanicamente tritata con lame di rasoio sterile e pinze. La sospensione delle cellule tumorali viene triturato con un 5-mL pipetta sierologica 10 volte. I pezzi del tumore dovrebbe essere abbastanza piccolo da non intasare il 5-mL pipetta sierologica. La sospensione delle cellule tumorali viene trasferito in un tubo da 50 ml conica contenente il volume residuo della cellula dissociazione buffer (riempito meno del 50%) e in agitazione alla massima velocità per 1 minuto. La sospensione delle cellule tumorali è quindi incubate a 37 ° C per 2 ore con vortex intermittente per 1 minuto ogni 20 minuti. 3. Riducono sospensione di cellule di detriti dei tessuti e le cellule morte Dopo le 2 ore di incubazione, la sospensione cellulare è in agitazione alla massima velocità per 1 minuto. La sospensione cellulare viene poi passato attraverso un filtro di 70 micron e raccolti in un nuovo tubo da 50 ml conica e portato a un volume finale di 15 ml per provetta. Per ulteriori celle separate vitali dalle cellule morte e detriti dei tessuti, la sospensione delle cellule tumorali viene separata per centrifugazione densità con Ficoll-Paque Plus. Un sottostrato di Ficoll-Paque Plus è creato da pipeting 15 ml di Ficoll-Paque In più lentamente sotto la sospensione cellulare facendo attenzione a non mescolare i due strati. La sospensione cellulare e gli strati Ficoll si è centrifugato a 500x g per 30 minuti con i freni spento. Cellule a livello di interfaccia di Ficoll-Paque Plus e cellule tampone dissociazione sono raccolti e trasferiti ad un nuovo 50-ml tubo conico. Fresco DMEM supplementato con 10% FCS si aggiunge alla sospensione cellulare di diluirlo 1:3 (es. 20 ml di mezzi freschi aggiunto a 10 ml di sospensione cellulare). Le cellule vengono raccolte mediante centrifugazione a 450x g per 10 minuti, i media decantato, e il pellet cellulare viene risospeso in 1 ml di tampone ALDEFLUOR. Dieci microlitri di sospensione cellulare viene diluito con 10 L trypan blu e cellule vitali vengono conteggiati utilizzando un emocitometro. Se un gran numero di cellule morte o frammenti di tessuto sono noti in questa fase, poi separazione cellulare mediante centrifugazione densità può essere ripetuto (passi 3,3-3,7). 4. Macchia Celle per fluorescenza ordinamento cellulare attivo Etichetta sette 12 x 75 mm provette di polistirene come segue: Senza macchia CD44-APC CD24-PE topo CD31-biotina + mouse lignaggio-biotina + mouse H-2Kd-biotina ALDEFLUOR ALDEFLUOR DEAB + + IgG 2bκ-APC + IgG 2aκ-PE ALDEFLUOR + CD44 + CD24-APC-PE + mouse + CD31-biotina-biotina lignaggio del mouse + mouse H-2Kd-biotina. Diluire la sospensione di cellule in 2 ml di tampone ALDEFLUOR ad una concentrazione finale di 5-10 milioni di cellule / ml e tenere in ghiaccio. Aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare ai tubi # 1, 2, 3 e 4 e tenerli su ghiaccio. Aggiungere 1 DEAB microlitri per tubo # 6 e tenere in ghiaccio. Aggiungere il reagente ALDEFLUOR alla sospensione cellulare residua diluita 1000 – volte (ad esempio aggiungere 1,6 microlitri di reagente ALDEFLUOR a 1,6 ml di sospensione cellulare), mescolare bene, e posto sul ghiaccio. Trasferire 100 ml di questa miscela a tubi # 5 e 6, e la miscela rimanente (1,4 ml) al tubo # 7. Incubare tutte le provette in un bagno d'acqua a 37 ° C per 40 minuti. Mescolare la sospensione cellulare ogni 10 minuti per evitare che le cellule di assestamento al fondo dei tubi. Centrifugare le cellule a 450x g e 4 ° C per 10 minuti e poi decantare il buffer. Risospendere il pellet in tubi # 1 e 5 in 100 microlitri di buffer ALDEFLUOR. Per tubi # 2, 3, 4 e 6, aggiungere 100 ml di tampone ALDEFLUOR contenente gli anticorpi adeguati diluita come segue: 1:20 per IgG 2bΚ-APC, IgG 2aΚ-PE, CD44-APC, e CD24-PEanticorpi; 1:100 per mouse CD31-biotina, mouse lignaggio-biotina, mouse e H-2Kd-biotina anticorpi. Per tubo # 7 aggiungere 1,4 ml di tampone ALDEFLUOR contenente una diluizione 1:20 di CD44-APC, e anticorpi CD24-PE e una diluizione 1:100 del mouse CD31-biotina, mouse lignaggio-biotina, e mouse H-2Kd-biotina anticorpi. Incubare le sospensioni delle cellule in ghiaccio per 10 minuti. Centrifugare le cellule a 450x g e 4 ° C per 10 minuti e poi decantare il buffer. Risospendere il pellet in tubi # 1, 2, 3, 5, e 6 in 100 microlitri di buffer ALDEFLUOR. Preparare 1,5 mL di tampone ALDEFLUOR contenente una diluizione 1:100 di streptavidina-PerCP proteine. Aggiungere 100 ul a tubo # 4 e aggiungere 1,4 ml di tubo # 7. Incubare le sospensioni delle cellule in ghiaccio per 10 minuti. Centrifugare le cellule a 450x g e 4 ° C per 10 minuti e poi decantare il buffer. Risospendere il pellet in tubi # 1, 2, 3, 4, 5, e 6 in 200 microlitri di buffer ALDEFLUOR. Risospendere il pellet in tubo # 7 in 2,8 mL di tampone ALDEFLUOR contenente 2 mg / ml di ioduro di propidio. Sì che le tubature su ghiaccio in ogni momento. Passano attraverso le cellule di 35 micron con filtro 12 x 75 mm provette di polistirene con tappi filtro. 5. Isolate cellule staminali del cancro da fluorescenza ordinamento cellulare attivo Un citofluorimetro FACSAria è pronto per l'ordinamento delle cellule. Controlli di compensazione sono impostate utilizzando cellule di tubi # 1, 2, 3, 4 e 5. Gates vengono creati in base al futuro e side-scatter parametri per la raccolta delle cellule singoletti. Senza mouse (PerCP-negativo) e vitali (non macchiato ioduro di propidio) le cellule sono gated utilizzando il FL-3 canali. ALDH cellule + sono raccolti sulla base di cancelli creati utilizzando DEAB cellule trattate (tubo # 6) e la FL-1 canale. Cellule CD44 + CD24 + sono raccolti sulla base di cancelli creati utilizzando cellule colorate con ALDEFLUOR, IgG 2bΚ-APC, e IgG 2aκ-PE (tubo # 6) utilizzando il FL-4 e FL-2 canali. Le cellule sono raccolte in 12 x 75 mm in polistirene tubi di prova contenente 1 ml di DMEM supplementato con 10% FCS. Dopo che le cellule sono state ordinate, centrifuga la sospensione cellulare a 450x g per 10 minuti, decantare i media, e sospendere nuovamente le cellule in 500 microlitri DMEM fresca supplementato con 10% FCS. Contare il numero di celle ordinate usando un emocitometro come descritto al punto 3.8. 6. Rappresentante Risultati Questo protocollo porterà all'isolamento di ALDH + e CD44 + CD24 + pancreas CSC. La percentuale di cellule di topo derivati ​​è variabile, ma abbiamo trovato che la maggior parte xenotrapianti cancro al pancreas umano contiene 20-60% di cellule di topo derivate usando il mouse CD31, cocktail lignaggio del mouse, mouse e H-2Kd biotina anticorpi coniugati (Figura 1A ). Allo stesso modo la frequenza di ogni popolazione CSC da diversi xenotrapianti è variabile, ma in generale abbiamo trovato che il 1-4% della popolazione totale di cellule è ALDH + (Figura 1B) e 0,2-5% è CD44 + CD24 + (Figura 1C). Noi abitualmente manualmente contare le celle ordinate usando un emocitometro quanto i conteggi macchina FACSAria sono spesso imprecisi a causa della non-cellulari particelle rilevato dal FACSAria. Figura 1. Citometria a flusso trama raffigurante popolazioni specifiche di trapianto di cancro al pancreas. (A) Cellule colorazione positivamente nella FL-3 canali (propidio ioduro +, CD31 + + topo lignaggio del mouse, o il mouse H-2Kd +) sono esclusi in modo da isolare solo vitali e non topo cellule derivate. (B) l'attività ALDH in caso di trapianto di cancro pancreatico umano è stato misurato mediante citometria di flusso utilizzando il reagente ALDEFLUOR in presenza e in assenza di inibitore ALDH1 dietilammino-benzaldeide (DEAB). I telai rappresentano cancelli che raffigurano le cellule + ALDH che sono stati creati sulla base di cellule trattate con DEAB e poi applicata a cellule non trattate. Le percentuali di cellule + ALDH sono riportati nella porta. (C) La CD44 + CD24 + cancello è stato creato sulla base di cellule colorate con ALDEFLUOR, e IgG 2bκ-APC (controllo isotipico per CD44-APC) e IgG 2aκ-PE (controllo isotipico per CD24-PE) gli anticorpi. Le percentuali di cellule CD44 + CD24 + sono mostrati in porta.