该协议涉及非放射性<em>原位</em>杂交程序,使在脊椎动物的大脑薄片,同时识别两个种成绩单,在一个单细胞的决议。
在这里,我们描述了一个双荧光修改后的版本<em>原位</em优化杂交(dFISH)方法检测mRNA的新鲜冰冻脑切片的兴趣。我们的小组已经成功地使用这种方法,研究基因的共同监管。更具体地说,我们使用的dFISH方法,探讨组织的解剖,神经化学物质的属性,和感官体验在中央感官电路的影响,在单细胞分辨率。在小鼠,大鼠和鸣禽脑组织,但该协议已经得到验证,预计将很容易适应其他脊椎动物物种,以及非神经组织的数组。在这部影片中,我们提供详细演示了此过程的主要步骤。
我们使用这个协议来研究脊椎动物的大脑是如何neurochemically和功能组织,并确定如何行为相关的感官刺激的影响在成人大脑 8-10元基因组机械。我们已经成功地使用这种方法在小鼠,大鼠和鸣禽脑组织,但预计此协议将很容易适应从脊椎动物物种的阵列,或许非神经组织得到的脑切片。需要获得可靠的结果和最佳的信号的关键控制已经详细广泛,本集团其他地方11,12 。
The authors have nothing to disclose.
NIH / NIDCD和施密特基金会到RP的赠款支持的工作。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
DEPC | VWR | IC15090225 | toxic substance | |
PCR purification kit | QIAgen | 28104 | ||
Formaldehyde | VWR | BDH0506-4LP | toxic substance | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | ||
T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | ||
Tris-HCl (1 M, pH 7.5) | VWR | IC816124 | ||
MgCl2 (1 M) | Sigma | 449172 | ||
Spermidine (1 M) | Sigma | S0266 | ||
DIG RNA labeling mix | Roche | NC9380805 | ||
Biotin RNA labeling mix | Roche | NC9440104 | ||
RNasin | Promega | N2111 | ||
BSA | Sigma | 05491 | ||
DTT | Sigma | D5545 | ||
Sephadex G50 | VWR | 95016-772 | ||
EDTA | VWR | 101384-758 | ||
SDS | Sigma | L4390 | ||
Transfer (t)RNA | Invitrogen | 15401011 | ||
10X MOPS | VWR | 14221-398 | toxic substance | |
Paraformaldehyde | VWR | AAAL04737-36 | toxic substance | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | ||
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | ||
NaOH | VWR | SX0600-1 | ||
Triethanolamine | VWR | IC15216391 | ||
Acetic anhydride | VWR | MK242002 | toxic substance | |
SSPE | VWR | 82021-488 | ||
Formamide | VWR | JT4028-1 | toxic substance | |
Poly A | Invitrogen | POLYA.GF | ||
Mineral oil | VWR | IC15169491 | ||
Chloroform | VWR | BDH1109 | organic solvent | |
Deionized formamide | Sigma | F9037 | toxic substance | |
Hydrogen peroxide | VWR | VW36901 | toxic substance | |
Tween 20 | Sigma | P1379 | ||
Triton X-100 | J. T. Baker | X198-05 | ||
Anti-DIG HRP | Roche | 11093274910 | ||
Anti-biotin peroxidase | Vector | SP3010 | ||
TSA Alexa Fluor 594 | Invitrogen | T20935 | ||
TSA Alexa Fluor 488 | Invitrogen | T20932 | ||
Hoechst | VWR | 200025-538 | ||
Vectashield | Vector | H-1000 | ||
embedding mold | VWR | 15160-157 | ||
cryostat | Leica | CM 1850 | ||
Superfrost plus slide | VWR | 89033-052 |
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