Определение дизрегуляции Гены индуцированные саркомы связанных герпеса Капоши (KSHV)
Summary
Факторов клетки-хозяина играет важную роль в установлении и поддержании саркома Капоши (СК). Мы выделяем методы выявления факторов клетки-хозяина изменены KSHV-инфицированных DMVEC клеток, и в ткани опухоли KS. Сотовая гены изменены вирус будет служить потенциальной мишенью (ы) для терапии романа.
Abstract
В настоящее время КС является наиболее преобладающим вопросам ВИЧ / СПИДа злокачественности в Южной Африке и, следовательно, мира. 1,2 Он характеризуется как angioproliferative опухоли сосудистых эндотелиальных клеток и производит редкие ячейки B лимфопролиферативных заболеваний в виде плеврального выпота лимфомы (PEL) и некоторые формы болезни многоцентровое Кастельмана. 3-5 Только 1-5% клеток в KS поражения активно поддерживать литической репликации саркомой Капоши связанные герпеса (KSHV), этиологическим агентом связанные с КС, и ясно, что клеточные факторы должны взаимодействовать с вирусными факторами в процессе онкогенеза и опухолевой прогрессии. 6,7 Выявление новых хост-фактора детерминанты, которые способствуют KS патологии имеет важное значение для разработки прогностических маркеров для прогрессирования опухоли и метастазов, а также для разработки новых терапевтических средств для лечения KS 8. сопровождающих детали видео методы мы используем, чтобы идентифицировать клетки-хозяина экспрессии генов программ изменены в кожных капилляров эндотелиальные клетки (DMVEC) после заражения KSHV и в опухолевой ткани KS. 9 После дизрегуляции генов идентифицированы с помощью анализа микрочипов, изменения в экспрессии белка являются подтверждается иммуноблота и двойной помечены иммунофлюоресценции. Изменения в экспрессии транскрипционных генов дизрегуляции подтверждены в пробирке количественными реальном времени полимеразной цепной реакции (QRT-PCR). Проверка в пробирке результаты, используя архивные опухоли KS ткани, проводится методом двойной помечены иммунохимии и тканей микрочипов. 8,10 Наш подход к определению дизрегуляции генов в ткани опухоли микроокружения KS позволит развития в пробирке, а затем в естественных условиях модельных систем для обнаружение и оценка потенциальных терапевтических роман для лечения КС.
Protocol
Discussion
Методологий, используемых в этом отчете могут быть выполнены в различных лабораторных условиях. Они требуют специального оборудования или доступ к основным объектов. Надлежащие меры предосторожности должны быть приняты при выполнении экспериментов инфекционных вирусных патогенов, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Джеймса К. Хилдрет, Мехарри медицинский колледж, за его советы и обзор этой рукописи. Мы также благодарим Диана Marver для редактирования рукописи. Эта работа была поддержана Мехарри Вандербильта Центр исследований СПИДа (NIH грант P30 AI054999-05); Центра исследований СПИДа неравенствам в отношении здоровья, NIH грант 5U54 RR019192-05; Мехарри Центра клинических исследований, грант NIH P20RR011792, а к NIH грант P01 CA113239. DJA частично финансировалась пилот гранты от Вандербильт-Мехарри Центра исследований СПИДа (CFAR) и Мехарри Центра клинических исследований (КПР).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | ||
| TPA | Sigma | P1585 | ||
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | ||
| Sodium butyrate | Sigma | 19364 (FLUKA) | ||
| EBM-2 media | Lonza | CC-3156 | + bullet kits supplement | |
| DMVEC cells (HMVEC) | Lonza | CC2543 | ||
| Fetal calf serum | Hyclone | SH30066.03 | ||
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Chamber slides | Nalgene | 154461 | ||
| KSHV LANA Mab | Vector Labs | VP-H913 | 1:50 dilution/IFA | |
| Galectin-3 goat pAb | R&D Systems | AF1154 | ||
| Donkey-anti-goat FITC | Jackson ImmunoRessearch | 705-095-1 | ||
| Donkey-anti-goat Rho | Jackson ImmunoRessearch | 705-295-003 | 1:100 dilution/IFA | |
| Mounting media | Vector Labs | H 1500 | Vectashield with DAPI | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23235 | ||
| Nitrocellulose | Bio-Rad | 161-0112 | ||
| Donkey-anti-goat-conj. | Santa Cruz | SC 2020 | ||
| Western substrate | Pierce | 34075 | ||
| Biotin-rabbit-anti goat | DAKO | 305-065-045 | ||
| AP-Strepavidin conj. | DAKO | K 0492 (kit) | ||
| RNase DNase Free Set | Qiagen | 79254 | ||
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | ||
| Bio-Photometer | Eppendorf | 952000006 | ||
| RC 6 Plus Centrifuge | Sorvall | 46910 | ||
| Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman | 392052 | ||
| MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System | Bio-Rad | 170-9770 | ||
| TE 2000S Fluorescent microscope | NIKON | TE2000S | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938C | ||
| Eclipse E 200 | NIKON | E 200 | ||
| Sorvall Legend RT Centrifuge | Thermo | 75004377 |
References
- Sitas, F., Newton, R. Kaposi’s sarcoma in South Africa. J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).
- Moore, P. S., Chang, Y., Knipe, D. M., Howley, P. M. Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus. Field’s Virology. , 2803-2833 (2002).
- Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).
- Cesarman, E., Knowles, D. M. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi’s sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman’s disease. Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).
- Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. J Virol. 76, 3421-3439 (2002).
- Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells. J Virol. 71, 715-719 (1997).
- Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi’s sarcoma. Glycobiology. , (2009).
- Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Spindle cell conversion by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures. J Virol. 75, 5614-5626 (2001).
- Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma. Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).
