Visualizzazione Cell-per-cell trasferimento del virus HIV usando cloni fluorescenti di HIV e Live Microscopia confocale

Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in Hübner et al Science 323:. 1743-1747 (2009) . 1. Panoramica Cellula-cellula diffusione del virus HIV è stato originariamente descritto utilizzando cellule Jurkat infette da HIV, come cellule del donatore e CD4 + linfociti T primari come cellule accettore 1,2,3. In questi studi, il virus è stato individuato nelle cellule fissate con colorazione degli anticorpi. Per tracciare il trasferimento del virus da cellula a cellula in cellule vive, abbiamo sfruttare una ricombinante, clone molecolare infettivo dell'HIV chiamato HIV Gag-iGFP 4. Essa svolge la proteina verde fluorescente (GFP) inserito internamente nella proteina Gag tra i domini MA e CA. Questo clone molecolare di HIV mantiene infettività senza la necessità di virus helper. Particelle virali fatto da questo clone stechiometricamente sono caricati con una proteina fluorescente verde, fornendo un forte segnale di fluorescenza per il monitoraggio di assemblaggio virale e il trasferimento tra le cellule. Quando utilizzato in combinazione con inerti cellula-tracking coloranti fluorescenti, le cellule destinatario può essere discriminato dalle cellule del donatore di input, e permettendo di visualizzare il trasferimento del virus da una cellula T infetto a una cellula T non infetti 5. Formazione di sinapsi virologici e il trasferimento del virus da una cellula all'altra può essere osservata nelle cellule viventi mentre sono coltivate in un contenitore sigillato, gas-permeabili camera di imaging. (Giorno 1) 2. Preparazione di HIV Gag-iGFP transfettati cellule T Jurkat Preparare il CD4 umano + T linea cellulare Jurkat (ATCC, Manassas, VA) con cura mantenendo le cellule ad una concentrazione tra 2 x x 10 5 e 8 10 5 cellule / ml in Jurkat cultura dei media (RPMI 1640, 10% di siero fetale bovino, 100 unità / ml penicillina e 100 mg / ml streptomicina). La chiave del successo: la cultura delle cellule Jurkat a concentrazioni superiori a 8 x 10 5 cellule / ml si tradurrà in una riduzione di efficienza di trasfezione. Nota: La transfezione Gag di HIV-iGFP DNA provirale nelle cellule T, come descritto di seguito, i risultati nella produzione di una capaci di replicazione del virus dell'immunodeficienza umana. Come tale, tutte le operazioni dovranno essere effettuate esclusivamente da personale addestrato in laboratorio certificato livello di biosicurezza 2 + o biosicurezza di livello 3 (BL2 + / BL3) camere colture di tessuti. Lavora con infettivo nelle strutture di imaging deve essere approvata dal vostro ufficio locale istituzionali biosicurezza. Trasfezione le Jurkats con il plasmide virale, l'HIV Gag-iGFP con il metodo nucleofection Amaxa (Lonza, Walkersville, MD). Pellet 5 x 10 6 cellule per centrifugazione per 10 min a 150 x g. Aspirare il surnatante e lavare le cellule in soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS). Centrifugare le cellule e risospendere il pellet a 97 ml di pre-riscaldato, V soluzione nucleofector contenente supplemento del produttore. Aggiungere tre ml di endotossina libero HIV Gag-iGFP plasmide (1 mg / mL) alla sospensione cellulare e mescolare delicatamente. Trasferire la sospensione cellulare ad una cuvetta e nucleofect utilizzando il programma S-18. Trasferire immediatamente le cellule a 3 ml di media cultura preriscaldata Jurkat senza antibiotici. Per preparare cellule CD4 + obiettivo per sinapsi virologica, si ottengono cellule mononucleari del sangue periferico da buffy cappotti usando uno standard di Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Svezia) il protocollo. Cellule T CD4 + sono poi negativamente selezionati utilizzando un kit magnetico isolamento tallone (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Questi possono essere memorizzati in criogenicamente N2 liquido in aliquote di 5 x 10 6 cells/500 l di mezzi di congelamento (90% fetale bovino DMSO serum/10%). Scongelati CD4 + primaria cellule T sono coltivate in RPMI 10% FBS, integrata con 10 unità / ml di IL-2. (Giorno 2) 3. Recupero di cellule vive da Jurkats transfettati con l'HIV Gag-iGFP e colorazione delle cellule bersaglio con tinture fluorescenti Consentire alle cellule Jurkat a riprendersi dalla transfezione durante la notte. Quindi rimuovere i detriti cellulari per centrifugazione su un gradiente di materiale Hypaque Ficoll densità. Dispensare 1,5 ml di Ficoll-Paque al fondo di un tubo da 15 ml. Delicatamente sovrapposizione questo materiale con il gradiente Jurkats transfettate in un volume di 5 ml di RPMI. Centrifugare le cellule a 400 xg per 20 minuti a temperatura ambiente con il freno. Rimuovere con attenzione le cellule da parte dei media / Ficoll interfaccia utilizzando una pipetta. Trasferirli in un nuovo tubo 15 ml. Diluire le cellule con RMPI ad un volume totale di 15 ml e centrifugare a 300 xg per 10 min. Risospendere il pellet in 3 ml di terreni di coltura Jurkat in ben 2 centimetri (6-pozzetti) e ritornare le cellule al tessuto culturale incubatore. Per distinguere le cellule bersaglio dalle cellule del donatore nella cellula-cellula esperimenti di trasferimento abbiamo prelabel le cellule CD4 + bersaglio con coloranti fluorescenti. Primario delle cellule CD4 + T sono contrassegnati anche l'zione prima dell'uso. Abbiamo avuto ottimi cellule T successo etichettatura sia con CellTracker e coloranti CellTrace (Invitrogen, Carlsbad, CA). Mentre la concentrazione di colorante e tempi di incubazione devono essere ottimizzati a seconda del colorante particolare tipo di cellule, un protocollo di rappresentante segue. Pellet di 4 x 10 6 cellule CD4 + T primarie facendo girare a 400 xg per 10 min. Lavare le cellule con 5 ml di PBS e risospendere in 2 ml di PBS. Aggiungi CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) ad una concentrazione finale di 1,5 mM e incubare a 37 ° C per 20 min. Aggiungere 8 ml di media Jurkat completo e centrifugare a 400 xg per 10 min. Risospendere le cellule in 3 ml di mezzi di comunicazione completo integrato con 10 unità / ml di IL-2 e il luogo nel tessuto della cultura incubatore durante la notte. (Giorno 3) 4. Monitoraggio Cell-per-cell trasferimento di HIV Gag-iGFP dell'immagine in tempo reale utilizzando cellule Noi abitualmente uso HIV Gag-iGFP cellule Jurkat trasfettate 48 ore dopo la trasfezione. Tuttavia, abbiamo utilizzato con successo le cellule già da 24 ore, e non più tardi di 72 ore dopo la trasfezione. Circa 48 ore dopo la trasfezione, HIV Gag-iGFP Jurkats esprimono sono contati, lavati con CO 2-media indipendenti (Invitrogen, Carlsbad, CA), e risospesi in vivo delle cellule e pubblicitario (CO 2 media indipendenti, il 10% siero fetale bovino, 100 U / ml penicillina e 100 mg / ml streptomicina, 10 unità / mL di IL-2) ad una concentrazione di 1-3 x 10 7 cellule / ml. In modo simile, lavare e risospendere etichettato CD4 + primaria cellule T ad una concentrazione di 1-3 x 10 7 cellule / ml in live media di imaging cellulare. Mix HIV Gag-iGFP transfettate Jurkats con CD4 + linfociti T primari con un rapporto 1:2 o 1:3 e caricare in una cultura tessuto trattato, gas permeabili, microchamber (Ibidi, Verona, WI). Per esempio, mix 20 ml di HIV-Gag iGFP Jurkats transfettate con 40 ml di etichettate CD4 + linfociti T primari. Carico di 50 ml di questa miscela in una camera Ibidi e sigillare la camera con spine. Fissare le spine avvolgendo la spina / interfaccia camera Ibidi con parafilm. 5. Considerazioni per le piattaforme di microscopia: disco rotante di imaging confocale Dopo aver caricato una camera di imaging Ibidi con le cellule, abbiamo immediatamente montare il dispositivo su un microscopio ottico invertito (iX71 Olympus, Center Valley, PA). La camera Ibidi dovrebbe essere trasferito al microscopio solo BL2 + personale qualificato laboratorio di indossare indumenti appropriati. Anche se vivo a celle di imaging utilizza comunemente camere di incubazione costosi da mantenere un ambiente stabile a 37 ° C, questo è stato realizzato utilizzando un calorifero semplice ed economico termostatica (ASI 400, Nevtek, Williamsville VA) insieme a una di tipo T punta della termocoppia montato accanto al il campione di feedback temperatura corretta. Abbiamo trovato con CO 2-media indipendenti ci permette di mantenere alta la vitalità delle cellule, evitando l'uso di una camera di CO 2. Per attenuare gli piattaforma contro le fluttuazioni di temperatura nella stanza e per bloccare Sala luce di fondo, un grande velo nero è drappeggiato su tutto il microscopio / riscaldatore configurazione creando una sacca d'aria isolante intorno al sistema. Questo riduce notevolmente variazione di temperatura e di temperatura associati legati deriva campione, ma necessita di pre-riscaldamento per 30 minuti prima del montaggio del campione. 6. Acquisizione dati, trasferimento e Image Processing Le immagini sono prese utilizzando un obiettivo 60x 1,42 olio NA immersione (UPlanApo N, Olympus), come l'apertura ad alta numerica (NA) migliora notevolmente la risoluzione. Per creare immagini 3D confocale, la scansione viene eseguita da un'unità disco rotante confocale (CSU-10, Yokagawa, Giappone) che utilizza contemporaneamente> 800 punti confocale di aumentare notevolmente la velocità di scansione. Per completare la sua velocità, la CSU-10 è accoppiato con un elevata sensibilità elettroni moltiplicando charged-coupled device (EMCCD, ixon + 897, Tecnologie Andor, Irlanda) fotocamera per consentire veloci, di immagini a bassa luce che riduce sia photobleaching e fototossicità. La sorgente luminosa a fluorescenza è un multi-lunghezza d'onda ARKR agli ioni di gas di laser (Innova 70C, Coherent, Santa Clara), dove la lunghezza d'onda desiderata (488 nm) e la potenza del laser misurata a destra prima l'obiettivo microscopio (<1 mW) vengono selezionati da un acusto- filtro ottico sintonizzabile (AOTF), (Tecnologie Andor). Per ridurre ulteriormente photobleaching ed estendere il tempo totale di imaging, il AOTF rapidamente (microsecondi) si spegne il fascio laser ogni volta che la fotocamera è attiva (10-20 ms), mentre l'immagine appena acquisita viene consegnato dal CCD (15-30 esposizione ms) al computer. La luce laser viene accoppiato al sistema utilizzando un disco rotante quad 405/488/568/647 banda specchio dicroico (Semrock, Rochester, NY). Emissione di fluorescenza viene filtrato con un filtro passa-banda 525/50 (Semrock) all'interno di una ruota portafiltri (Ludl prodotti elettronici, Hawthorne, NY) montato bra la fotocamera EMCCD e l'unità confocale disco rotante. Tutto l'hardware e l'acquisizione, tra cui un z-stadio (Mad Labs Città, Madison, WI), sono controllati dalla iQ Andor v1.8 software. Per massimizzare la velocità di acquisizione a circa 1,2-1,9 stack seconda immagine 3D, si taglia la zona di registrazione della fotocamera del EMCCD è scesi a immediate vicinanze della cellula-coppia. Inoltre, a scapito di qualche informazione in z, z-un grande passo tra 0,45-0,75 micron può essere usato per velocizzare l'acquisizione. Imaging in queste condizioni può durare fino a 6 ore – con continuo segmenti 20-60 minuti – con photobleaching minima. Complessivamente, ogni segmento di dati occupa tipicamente 5-20 Gb di spazio, come decine di migliaia di immagini sono tratte. Per facilitare il trasporto e l'analisi dei file di dati di grandi dimensioni, ogni set di acquisizione deve essere scomposto e esportati come 1 Gb segmenti di file immagine TIFF utilizzando il software v1.8 Andor iQ. Da qui, molti pacchetti software eccellenti sono disponibili per l'analisi delle immagini, come ad esempio Metamorph, Volocity e ImageJ (si consiglia la sua variazione Figi). Quando due marcatori fluorescenti devono essere monitorati, abbiamo registrare simultaneamente entrambi senza rallentare l'acquisizione utilizzando una "modalità split screen." Entrambi i marcatori sono eccitati da due diverse linee laser ARKR in una sola volta (spesso 488 e 568 nm). Inseriti direttamente prima che la fotocamera EMCCD è un'immagine splitter (OptoSplit II, Cairn, Kent, UK) che separa le due immagini diverse. Ogni immagine viene poi filtrata in modo indipendente con filtri a fluorescenza (Semrock) e proiettate fianco a fianco la fotocamera in una sola volta creando l'effetto "split-screen". Questo sarebbe poi richiedere il ritaglio manuale e l'allineamento delle immagini più avanti in elaborazione delle immagini. 7. Considerazioni per la elaborazione delle immagini e analisi dei dati Noi di solito effettuare analisi di immagine con Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) su computer Macintosh (Apple, Inc). Disco rotante immagini di microscopia laser confocale vengono prima corretti per la loro intensità per correggere photobleaching, poi deconvolved con Volocity. Misure di intensità e il monitoraggio di puncta Gag è effettuata con il modulo Quantificazione Volocity. Per i set di immagini in cui il movimento relativo ad un pre-formata sinapsi deve essere calcolato, un algoritmo di tracciamento automatico è impiegata che segue il pulsante sinaptica durante l'intera sequenza. Ispezione manuale di regioni di interesse definito dal software autotracking deve essere eseguito per confermare che il software è correttamente rintracciato l'oggetto desiderato. Per gli oggetti in cui il contrasto con gli oggetti circostanti è troppo debole, il tracking manuale può essere eseguita su un fotogramma per fotogramma. Il pacchetto software Volocity permette l'esportazione di posizione XYZ, volume e segnale integrato all'interno gli oggetti desiderati. La distanza dalla sinapsi e la velocità dell'oggetto monitorati sono calcolati normalizzando i movimenti al centro del bottone sinaptico. 8. Rappresentante Risultati Entro 10 a 15 minuti di miscelazione si dovrebbe essere in grado di visualizzare l'HIV Gag-iGFP cellule Jurkat che esprimono aderenti al CD4 + linfociti T primari. Imaging questi coniugati, si possano valutare i movimenti di puncta Gag nelle cellule infette e nelle cellule bersaglio dopo synaspe. Si può osservare il movimento di Gag-iGFP puncta all'interno delle cellule bersaglio poco dopo la sinapsi si formano.