تقنية نافذة رقيقة الجمجمة لالمزمنة ثنائي الفوتون في الجسم الحي التصوير من الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران نماذج من Neuroinflammation
Summary
نحن تصف طريقة لتصور مرارا الفئران الخلايا الدبقية الصغيرة وتعميم حيدات<em> في الجسم الحي</em> على مدى الأيام ، ساعات أو أسابيع باستخدام العابر لاثنين الفوتون المجهري. نحن لشرح كيفية إعداد إطار ضعفت – الجمجمة التي تتيح مراقبة متقطعة من الخلايا الدبقية الصغيرة هادئة التي يمكن تفعيلها عن طريق الحقن المجسم المتاخمة للتات HIV – 1 البروتين التنظيمية.
Abstract
تقليديا في علم الأعصاب في الجسم الحي وقد اشتركت رابطتان التصوير فوتون للنظام العصبي المركزي الفئران إما استخدام مفتوح 1،2 الجمجمة أو ضعفت الجمجمة – 3 التحضيرات. في حين أن الجمجمة المفتوح تقنية متعددة جدا ، فإنه ليس الأمثل لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة لأنها الغازية ويمكن أن يسبب تنشيط دبقية صغيرة. على الرغم من أن نهج ضعفت – الجمجمة مينيملي ، وتكرار إعادة ترقق الجمجمة المطلوبة للتصوير المزمن يزيد من مخاطر الاصابة الأنسجة وتنشيط دبقية صغيرة ويسمح لعدد محدود من جلسات التصوير. هنا نقدم مزمن أسلوب النافذة رقيقة الجمجمة لرصد الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران الحية على مدى فترة طويلة من الوقت باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. نحن لشرح كيفية إعداد وميسرة مستقرة وضعيفة ، الجمجمة النافذة القشرية (TSCW) مع ساترة الزجاج الشفاف الذي لا يزال apposed على مدى ثلاثة اسابيع من المراقبة على فترات متقطعة. هذا التحضير هو أكثر بكثير TSCW خامل مناعيا مع الاحترام لتفعيل دبقية صغيرة من حج القحف أو فتح الجمجمة المتكررة رقيق ويسمح لعدد من جلسات التصوير التعسفي خلال فترة زمنية تصل إلى أسابيع. نحن نستعد TSCW في 3 CX CR + 1 الفئران GFP / 4 لتصور الخلايا الدبقية الصغيرة مع بروتين الفلورية الخضراء لتعزيز 150 ميكرومتر ≤ تحت سطح حنوني. نعرض أيضا أنه يمكن استخدام هذا الإعداد بالاشتراك مع حقن الدماغ المجسم للبروتين HIV – 1 أعصاب تات ، بجوار TSCW ، وهي قادرة على إحداث microgliosis دائم. ولذلك ، فإن هذه الطريقة مفيدة جدا لدراسة التغيرات في التشكل والحركة دبقية صغيرة مع مرور الوقت في الدماغ الذين يعيشون في نماذج من اضطراب عصبي المرتبطين بفيروس نقص المناعة البشرية (اليد) وغيرها من الأمراض العصبية التي تحتوي على عنصر neuroinflammatory.
Protocol
Discussion
هناك اجماعا متزايدا على ان الركيزة الفعلية لHIV – 1 عجز عصبي المرتبطة بها (اليد) هو تدمير البنية متشابك ، المفترض أنها ناتجة عن التهابات وسطاء الموالية للصدر من HIV – 1 البالعات وحيدات النوى المصابة. تعتبر التنشيط دبقية صغيرة ، والخلايا العملاقة multinucleated ، ونظرا لتضخم دباق نجمي بصمات غير محدد من HIV – 1 العدوى والالتهابات في الجهاز العصبي المركزي 7. في المقابل ، ارتبط شدة المرض العصبي سابق للموت مع فقدان متشابك من التعقيد ، فضلا عن عبء البلاعم في الجهاز العصبي المركزي 8،9،10،11. ومع ذلك ، التفاعلات الدينامية بين الخلايا الدبقية الصغيرة ، الطرفية التسلل الضامة ، والخلايا العصبية لدى المرضى الذين يعانون HAND ببساطة لا يمكن أن تكون على غرار باستخدام المعالجة التقليدية الثابتة التي تم الحصول عليها من دراسات immunocytochemical التقليدية. وقد اقترحت الدراسات الحديثة من مختبراتنا التي يمكن أن تكون على غرار ما لا يقل عن بعض من هذه التفاعلات بين الخلايا وحيدة النواة المركزية والطرفية ، والخلايا العصبية في جزء منه عن طريق الحقن المجسم للبروتين HIV – 1 تات 1-72 في حمة الدماغ (لو ، ماركر ، تريمبلي ، تشي ، وGelbard ، بيانات غير منشورة). ولذلك قررنا أن تطبق في مجال التصوير فيفو الفوتون اثنين إلى دراسة التفاعل بين الوحيدات المستمدة الضامة ، الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ والخلايا العصبية المقيمين ، في نموذج حيوان صغير الانقياد لneuroAIDS. في حين أن الأعمال التحضيرية مفتوحة الجمجمة أو ضعفت الجمجمة وتحمل فحص واحد للعمارة القشرية لفترة وجيزة من الزمن (ساعة) ، والمحققين المهتمين دوام الأحداث تحت الحاد لا يمكن استخدام هذه المستحضرات دون تفعيل artifactually الخلايا الدبقية الصغيرة / بلعم بسبب التلاعب الجراحي نافذة قبي. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة بسيطة للتحايل هذه القيد بواسطة لصق قطعة صغيرة من الزجاج ساترة فوق منطقة الجمجمة ضعيفة منع من تجديد القبة في TSCW فضلا عن الحفاظ على شبه الشفافية لأسابيع 3 ≥. نظهر أيضا أن هذه التقنية تسمح لنا بمراقبة سلوك حيدات الطرفية دخول microvasculature الدماغي وكذلك الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ المقيم في الاستجابة لحقن المجسم من فيروس نقص المناعة البشرية 1-72 تات في القشرة من الفئران متخالف لCX CR 3 / 1 GFP ( لتحديد الخلايا وحيدة النواة من النسب). ويمكن بسهولة أن تتكيف هذه التقنية لاستخدامها في الفئران مع خلفيات وراثية مختلفة ، على سبيل المثال ، فإننا نستخدم عادة متخالف CX CR 3 / 1 GFP خاصتك X – 1 12 YFP الفئران لتحقيق التفاعل بين الوحيدات المستمدة الضامة ، الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة في الدماغ والخلايا العصبية في النماذج الحية من neuroinflammation ذات الصلة في متناول اليد. استعدادنا TSCW يسمح للمحققين لدراسة الخلية خلية التفاعلات بين المحيط والجهاز العصبي المركزي التي قد تحدث على مدى فترات من أسبوعين ، التي يمكن من خلالها تصوير الحيوان مرارا قبل وبعد العلاج التجريبي. وبالتالي ، يمكن لكل حيوان بمثابة ايقاعه. التحذير واحد لهذا النموذج TSCW هو أن الخلايا المستهدفة في إطار التحقيق بحاجة إلى أن يكون إما وراثيا في التعبير عن البروتينات الفلورية محسن (eXFP) أو أن يكون المسمى مع صبغة الفلورسنت دون الإخلال الميكانيكية من القبة ، وأنه يجب أن يكون التعبير eXFP قوية بما يكفي ل تسمح العمارة الخليوي الى أن تصور بعد دورات التصوير المتكرر على مدى فترة من أسابيع.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر اميلي ألف كيلي رئيس لتصميم لوحة.
نحن ممتنون للدعم من المعاهد الوطنية للصحة لجوائز HAG : PO1 MH64570 ، RO1 MH56838 ، RO1 MH078989 ، R21 MH03851 والدعم السخي للصندوق Waasdorp جيفري الأعصاب للأطفال والتي بدونها لن هذا العمل لم يكن ممكنا. وتمول من قبل المعاهد الوطنية للصحة بأنقرة (EY019277) ، ومؤسسة وايتهول ، وP. ألفريد سلون ومؤسسة جائزة شهادة في العلوم الطبية الحيوية من صندوق ويلكوم بوروز. وتمول من قبل MET دي فون LA RECHERCHE EN دو كيبيك سانتي (FRSQ) ما بعد الدكتوراه جائزة التدريب. سوق دبي المالي هو متدرب في برنامج التدريب الطبي العلماء ، بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة T32 GM07356 وAI049815 T32.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fentanyl Citrate | Hospira | |||
| Midazolam hydrochloride | Baxter | |||
| Medetomidine hydrocholoride (Domitor) | Pfizer | |||
| Heating pads | Beyond Bodi Heat | |||
| Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | |||
| Povidone-iodine 10% solution | Betadine | |||
| Ferric chloride 10% solution | Ricca Chemical Company | 3120-32 | ||
| Methyl cyanoacrylate 910 | Permabond | |||
| Cyanoacrylate 454 | Loctite | |||
| TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate | Co-Oral-lte Dental Mfg CO | |||
| Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | ||
| IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | ||
| Norland bendable microblade full radius | Salvin Dental | BLAD-NORLAND-69 | ||
| Cyanoacrylate | The Original Superglue | |||
| #0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | ||
| 10 μl Microvolume syringe | World Precision Instruments | ILS010LT | ||
| UltraMicroPump III | World Precision Instruments | UMP3-1 | ||
| 35 gauge NanoFil needle | World Precision Instruments | NL35BL-2 | ||
| Ball Mill, Carbide bits #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | ||
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 | ||
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
| Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |
References
- Mostany, R., &, P. o. r. t. e. r. a. -. C. a. i. l. l. i. a. u., C, . A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. 12, (2008).
- Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4, (2009).
- Yang, G. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protoc. 5, 213-21 (2010).
- Jung, S. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-41 (2000).
- Mrsic-Flogel, T. D. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-96 (2007).
- Majewska, A., Yiu, G., &, Y. u. s. t. e., R, . A custom-made two-photon microscope and deconvolution system. Pflugers Arch. 441, 2-3 (2000).
- Sharer, L. R. Pathology of HIV-1 infection of the central nervous system. A review. J Neuropathol Exp Neurol. 51, (1992).
- Everall, I. P., Aliberti, J., &, B. a. l. c. e. r. z. y. k., M, . Neuronal density in the superior frontal and temporal gyri does not correlate with the degree of human immunodeficiency virus-associated dementia. Acta Neuropathol (Berl. 88, 538-53 (1994).
- Masliah, E., Banati, R. B., &, Q. u. i. n. l. a. n., M, E. Dendritic injury is a pathological substrate for human immunodeficiency virus-related cognitive disorders. Ann Neurol. 42, 963-96 (1997).
- Everall, I. P., Banati, R. B., &, U. p. e. n. d. e. r., B, M. Cortical synaptic density is reduced in mild to moderate human immunodeficiency virus neurocognitive disorder. Brain Pathol. 9, (1999).
- Glass, J. D., Fedor, H., Wesselingh, S. L., &, M. c. A. r. t. h. u. r., C, J. Immunocytochemical quantitation of human immunodeficiency virus in the brain: correlations with dementia. Ann Neurol. 38, (1995).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, (2000).
