该协议提供了必要的成立,关心,录制和电刺激对多边环境协定的文化信息。<em在体外</em>网络提供了一个生理有关的问题,要求在网络和一个更好地理解大脑功能和功能障碍导致的细胞水平的手段。
对于上个世纪,世界各地的许多神经学家都献出生命的理解神经网络是如何工作的,为什么他们停止在各种疾病的工作。研究包括神经病理学观察,荧光显微镜与遗传标记,并在分离的神经元和切片准备细胞内记录。该协议将讨论另一种技术,其中包括日益增长的微电极阵列(也称为多电极阵列,多边环境协定)的游离神经文化。
使用这个系统比其他技术有多种优势。多边环境协定的游离神经文化提供了一个简化的模型中,网络活动可以通过阵列的多个电极电刺激序列操纵。因为网络是小的,刺激的影响是有限的,以观察到的领域,这是不完整的准备工作的情况下。在决策在形态上容易的变化监测各种成像技术单层细胞的生长。最后,文化上的多边环境协定可以存活超过一年的体外删除任何明确的时间限制,与其他养殖技术固有1 。
我们的实验室和世界各地的人都在利用这一技术,询问有关神经网络的重要问题。此协议的目的是提供必要的信息,为设立,关心,录制和电刺激对多边环境协定的文化。体外网络提供生理有关的问题,要求在网络和细胞水平,从而更好地理解的一种手段大脑功能和功能障碍。
此协议表明如何文化的指示,并维持神经网络的微电极阵列,以及录制和刺激神经网络的介绍。一些比较常见的问题,从多边环境协定的录像时,还讨论了在多边环境协定的故障排除部分。在协议中有偶尔的变化作为整个讨论和这些变化常常利用优化一定的实验设计所需的特定条件。
虽然这里介绍的是记录和刺激系统组成,设计与MCS前置NeuroRighter 15我们的自定义,有多个其他系统的神经网络,可以提供一个接口。选择一个特定的设置,将取决于具体的实验需要。
在这个协议提供了简单的记录和刺激的例子,然而,这些多边环境协定的文化,可用于提供有关突触活动和神经元网络连接复杂的问题的洞察力。如上所述,正在进行的工作是利用这种技术,像细胞的可塑性研究的过程,从我们的实验室最近出版的发展,兴奋性毒性和神经退行性疾病,例如6-10,表明重现性目标导向学习与实时闭环刺激在体外应对当前的神经网络活动3。
虽然多边环境协定的文化往往是挑剔的和微妙的,由于其简单性和可访问性(比较完整的动物),他们提供了一个强大的模型研究在网络层面的神经元活动。
The authors have nothing to disclose.
我们想感谢波特集团的成员,根据协议提供宝贵意见。这项工作是由临床研究培训奖学金从美国神经病学基金会学会CMH的,从国家普通医学科学研究所(NIGMS;奖学金http://www.nigms.nih.gov/ )JDR(GM08169 ),授予来自美国国立卫生研究院国家神经疾病研究所和中风(NS054809),一个露丝属Kirschstein国家研究服务奖JDR(NS060392),EFRI授予美国国家科学基金会(0836017),库尔特基金会翻译研究奖,和一个翻译研究奖学金JDR(NS007480)。
Supplies
Equipment:
Solutions and Reagents:
BSA solution:
Make 5% BSA (Sigma A-9418) in phosphate buffered saline pH 7.4 and filtered at 0.2μm. This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months.
Cell Medium:
Combine 90 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Irvine Scientific 9024), 10 ml horse serum (Gibco 16050), 1ml sodium pyruvate (100mM, Gibco 11360), 250 μl GlutaMAX (Gibco 35050), and insulin (final concentration 2.5 μg/ml, Sigma I-5500) then pass through a 0.2 μm filter.22 Warm and equilibrate the cell medium in the incubator prior to use.
Dissection solution for preparing papain solution:23
Dissection solution (100ml stock) | Combine in order, filter 0.22 μm and store at 4°C. | |
Component | Volume ml | Final Concentration (mM) |
Double-distilled water | 91.175 | |
1 M MgCl2 | 0.58 | 5.8 mM |
1 M CaCl2 | 0.025 | 0.25 mM |
0.5 M HEPES | 0.32 | 1.6 mM |
0.5% Phenol red | 0.2 | (0.001%) |
0.1 N NaOH | 0.2 | 0.2 mM |
2 M Na2SO4 | 4.5 | 90 mM |
1 M K2SO4 | 3.0 | 30 mM |
0.1 M Kynurenic acid | 1.0 | 1 mM |
5 mM APV | 1.0 | 0.05 mM |
This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months.
DNAse I:
Invitrogen (#18047019). 50μl aliquots are flash frozen and stored at -80°C. An aliquot is thawed in the laminar flow hood prior to starting the cell dissociation process.
Hank’s balanced salt solution:
Sigma (#4891). A 1X solution is prepared in deionized water, sterile filtered at 0.2μm and stored at 4°C.
Hibernate solution:
Prepare on day of culturing. Combine 98 ml L-15 medium (Invitrogen 11415) with 2 ml B-27 supplement (50X, Invitrogen #17504) and filter at 0.2 μm.
Laminin solution:
Prepare on day of culturing. Dilute 20μl of laminin (1mg/ml, Sigma L-2020) in 980 μl cell medium for a final concentration of 0.02mg/ml. 20 μl aliquots of the laminin (1mg/ml) are stored at -80°C and thawed just prior to use. Thawing should occur on the bench top and not in the water bath as rapid thawing can sometimes lead to gelling of the laminin.
Papain solution:23
Warm 10 ml of dissection solution (above) to 30-32°C. Add 200 units papain (Sigma P-4762) and 1.6 mg L-cysteine (Sigma C-7880). Adjust pH to 7.4 with about 14 μl of 0.1 N NaOH. Incubate for about 30 minutes until the solution clears, filter 0.2 μm, flash freeze with liquid nitrogen in 2 ml aliquots in 15 ml polypropylene sterile conical vials and store at -80°C. Thaw an aliquot at 35-37°C prior to starting protocol.
Polyethyleneimine (PEI) solution:13
100 μl of PEI (50% w/v, Sigma P-3143) is diluted in 100 ml sodium borate buffer (0.1 M pH 8.4, Sigma B-9876) for a final concentration of 0.05% w/v. Sterile filter at 0.2 μm. This can be prepared in advance and stored at 4°C for months.
Sterile de-ionized water:
Autoclave and allow to cool to room temperature prior to use.
Trypsin (0.25% with EDTA, Gibco 25200):
1ml aliquots are flash frozen and stored at -80°C. Aliquots are thawed in the 35-37°C water bath prior to use.