كيفية تسجيل والثقافة والحث على الشبكات العصبية الصغيرة مسرى صالحة (الاتفاقات)

ألف مقدمة هناك مليارات من الخلايا العصبية في الدماغ البشري. يمكن لكل من هذه الخلايا العصبية ومئات الآلاف من الاتصالات في كثير من الأحيان مع خلايا مختلفة كثيرة. هذه الاتصالات الميناء الإشارات التي تسمح لنا على المشي ، ولعب البيانو ، وركوب الدراجة ، والضحك ، والبكاء ، والتذكر. في القرن الماضي ، وقد كرس العديد من علماء الأعصاب في جميع أنحاء العالم حياتهم لفهم كيفية عمل الشبكات العصبية ، ولماذا توقفوا عن العمل في مختلف الأمراض. هناك العديد من الأدوات يمكن للمرء أن استخدام عند اتخاذ هذه المهمة لا يمكن التغلب عليها على ما يبدو. وتركزت الدراسات الأولية على الملاحظة neuropathological كيف يتم تنظيم الدوائر العصبية في أدمغة البشر والحيوانات الأخرى. توسيع ظهور المجهري مضان والتوسيم الجينية في نطاق هذه الدراسات البنيوية استكشاف تكوين الخلايا وصولا الى مستوى البروتين والحمض النووي. لكن هذه التجارب لم يتناول وظيفة حيوية في الدماغ ، إلا الترتيب ثابت. لفهم النشاط العصبي المستمر ، وتقنيات شعبية التركيز عموما على دراسة النشاط الكهربية مع تسجيل داخل الخلايا. خلايا عصبية واحدة من الثقافات نأت تقديم نموذج اختزالي مفيدة ، ولكن يقتصر هذا الأسلوب من خلال فترات زمنية قصيرة لتسجيل واحدة من الخلايا. هذا النموذج يوفر أيضا معلومات محدودة عن الخلايا الأخرى في الشبكة. شرائح من الدماغ القوارض توفر أكثر من نموذج واقعي ، حيث يتم الاحتفاظ بنية القشرية. ولكن مثل هذه الشرائح ، حتى عندما يكون المثقف ، لها عمر محدود ، ويمكن من الناحية الفنية الصعبة للحفاظ على الحياة مع الاحتفاظ التهندس الخلوي 2. تقنية أخرى تتضمن الثقافات المتزايد على فصل الخلايا العصبية الدقيقة الكهربائي صفائف (وتسمى أيضا متعدد القطب صفائف الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف). ومطلي الخلايا العصبية على الاتفاقات التي microelectrodes مضمن في قاع الطبق. على مدار ثلاثة أسابيع ، وهذه الثقافات تشكيل شبكات من الخلايا العصبية كاملة مع التشعبات ، والمحاور لم يكن مئات الآلاف من الاتصالات متشابك. هناك مزايا عديدة لاستخدام هذا النظام أكثر من غيرها من التقنيات. ثقافات العصبية نأت على الاتفاقات تقديم نموذج مبسط التي تعمل معها (بناء على أمر من عمود القشرية واحدة بدلا من الدماغ السليم). الخلايا تنمو في المونولاير إجراء تغييرات في سهل التشكل لمراقبة بتقنيات التصوير المختلفة. ويمكن التلاعب بها مع تسلسل نشاط الشبكة من خلال التحفيز الكهربائي أقطاب الصفيف متعددة. لأن شبكة صغيرة ، ويقتصر أثر التحفيز إلى مناطق يمكن ملاحظتها ، والذي ليس هو الحال في الأعمال التحضيرية سليمة. أخيرا ، والثقافات على الاتفاقات يمكن البقاء على قيد الحياة لأكثر من سنة في المختبر الذي يزيل أية قيود زمنية واضحة متأصلة مع تقنيات زراعة أخرى. 1 لذلك ، والثقافات على الاتفاقات تمثل نموذجا مثاليا لدراسة الربط العصبية. مختبرنا وغيرها في جميع أنحاء العالم وتستخدم هذه التكنولوجيا لطرح أسئلة هامة حول الشبكات العصبية. العمليات العصبية الحالية التي تجري دراستها مع هذا النموذج وتشمل ديناميات الشبكة ، والتنمية ، والتعلم والذاكرة ، اللدونة متشابك ، excitotoxicity ، نقص تروية وتنكس عصبي. 30-10 من نتائج هذه الدراسات يمكن أن يكون لها آثار كبيرة لإقامة أفضل العلاجات للأمراض الإنسان مثل التشوهات الخلقية ، والصرع والسكتة الدماغية ومرض الزهايمر. الغرض من هذا البروتوكول هو توفير المعلومات اللازمة لإقامة ورعاية ، وتسجيل من الثقافات وتحفيز على الاتفاقات. الهدف النهائي هو توفير وسيلة للباحثين لطرح الأسئلة ذات الصلة على المستويات الفسيولوجية الخلوية وشبكة الاتصال التي قد تؤدي ربما إلى فهم أفضل وظيفة الدماغ واختلال وظيفي في نهاية المطاف ، والعلاج من الأمراض التي تؤثر على الخلايا العصبية لدينا وكيف التواصل. بروتوكول التالية يمثل أكثر من 10 عاما من الخبرة من مختبرنا في زراعة ، من تسجيل وتحفيز الشبكات العصبية في الدقيقة الكهربائي صفائف. وقد تم تحسين كل خطوة بحيث تؤدي إلى تطوير شبكات الخلايا العصبية على قيد الحياة فترة طويلة بصحة جيدة. حيث يتم توفير المراجع المتاحة في حين أن بعض الإعدادات الأمثل نحن مصممون تجريبيا. قبل الشروع في البروتوكول ، والحصول على المعدات واللوازم وإعداد الحلول على النحو الوارد في القسم المعنون "المواد". وسوف يكون القسم الخاص ب "تشريح الدماغ" ناقشت لفترة وجيزة ، ولكن لم يظهر في شريط الفيديو المرافق وغيرها من المقالات اليومية تجربة متصور تغطية هذا الموضوع 11. تشريح الدماغ B. يتم استخراج أدمغة الفئران كلها من يوم 18 (E18) الجنينية. توقيت الحامل إناث الفئران هي تخدير مع isoflurane المستنشق ومقطوعة الرأس. تتم إزالة الأجنة وفقا لتشريح GUID المجلس الوطني للبحوث فيه لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية باستخدام بروتوكول IACUC التي وافقت عليها جامعة إيموري. مع استخدام تقنية العقيم ، تتم إزالة أدمغة الأجنة وضعت في محلول من أملاح الباردة هانك المتوازن (HBSS) في طبق بتري معقمة 100 ملم. ما تبقى من بروتوكول تشريح يحدث تحت المجهر تشريح في تدفق الصفحي غطاء لتقليل مخاطر التلوث. يتم نقل أدمغة الفئران في وقت واحد لطبق بتري معقمة الثانية مع HBSS للتشريح. بينما غرقت في HBSS ، يتم قطع جذع الدماغ ، المهاد والمخيخ وبعيدا شطر نصفي الكرة الأرضية. ويستخدم حاسة الشم لالحديبة كمقبض لتأمين نصف الكرة الغربي في حين إزالة بلطف السحايا. غير مقشر ثم القشرة بعيدا عن الحصين الكامنة والمخطط وتخزينها في أنبوب عقيم المخروطية 15 مل في حل السبات على الجليد (12). وبما أن هناك العديد من الأجنة عادة ، ويتكرر هذا الإجراء ثم اعتمادا على العدد المرغوب فيه من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف أن تكون مطلية وكثافة الخلايا المطلوبة. يتم الجمع بين قشرات للخلية تفارق عملية كما هو مبين أدناه. قد تكون مخزنة في القشور 4 درجات مئوية في حل السبات لمدة تصل إلى 24 ساعة قبل أن تفارق فقط مع فقدان الحد الأدنى من سلامة الخلية. كبديل لاستخدام تشريح الأنسجة في المنزل ، ويمكن تشريح أنسجة المخ يمكن شراء القطع من الدماغ ( www.brainbitsllc.com ). جيم MEA إعداد والتفكك القشرية يتم الحصول على الاتفاقات العلمية من ALA ( www.alascience.com ) ، بائع للمنتج ، متعدد القنوات الأنظمة. هناك عدة تكوينات مختلفة للاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف مع وجود اختلافات في اتجاه القطب والتباعد وجود أو عدم وجود أرض الواقع الداخلي ، والقطب أو عدم وجود خاتم الزجاج ، وحجم الحلقة الزجاج. لدينا تجارب الأساسية التي نستخدمها القياسية الدقيقة القطب مجموعة تحتوي على 60 الأقطاب في 8 من 8 ترتيب الشبكة مع حلقة صغيرة من الزجاج. القطب نيتريد التيتانيوم بقطر 30 ميكرون والمسافة بين مراكز الكهربائي هو 200 ميكرون. واحدة من أكبر الأقطاب ووظائفها ، وعلى الأرض أو الداخلية الإلكترود المرجعي. عند التعامل مع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف ، فإنه من الأهمية بمكان أن أي أجسام صلبة (على سبيل المثال ، نصائح ماصة ، مناديل ورقية ، أو من رجال الشرطة المطاط) لمسة من أي وقت مضى داخل الطبق حيث أن هذا يمكن أن تلحق الضرر الأقطاب. ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات التفصيلية حول الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف والتعامل معها في دليل المستخدم MEA ( www.multichannelsystems.com / منتجات شركة طيران الشرق الأوسط / microelectrode arrays.html – ). في مساء يوم قبل إعداد الخلية ، يتم شطف مع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف غير المتأينة المياه ، وسمح بعد ذلك للانغماس في الايثانول 70 ٪ لمدة 15 دقيقة. ثم توضع الصحون في التدفق الصفحي هود مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية على يلة وضحاها. لأغراض المناولة ، ويتم وضع كل شركة طيران الشرق الأوسط في مستوى 100 ملم العقيمة البوليسترين طبق بيتري مع التواريخ والعلامات الموضوعة على طبق بتري. من المذكرة ، وتقنيات التعقيم الأخرى بما في ذلك التعقيم واستخدام المياه على 90 درجة مئوية المذكورة في دليل مستخدمي شركة طيران الشرق الأوسط. ومع ذلك ، فقد وجدنا أن التعقيم يبدو تجريبيا لتقليل عدد المرات التي يمكن استخدامها اتفاق بيئي متعدد الأطراف. إذا كنت إعادة استخدام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف التي لديها حاليا الثقافات ، فلا بد من إزالة المواد العضوية. وحضنت 300-400 ميكرولتر من التربسين 0.25 ٪ في برنامج تلفزيوني على MEA في 35-37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. يتم شطف في الشرق الأوسط وأفريقيا مع غير المتأينة المياه وتفقد بعد ذلك مع المجهر الخفيفة. إذا كان الأمر لا يزال الخلوية ، ثم يتم تكرار هذه الخطوة حتى التربسين نظيفة. إذا كان الطبق غير نظيفة ، ثم المضي قدما في خطوة التعقيم على النحو الوارد أعلاه. عموما ، يمكن إعادة استخدامها مرات عدة الاتفاقات مع الرعاية المناسبة. أيضا مساء يوم قبل الطلاء ، وتعد شركة طيران الشرق الأوسط الأغطية وتعقيمها. الأغطية تصنع حسب الطلب ولكن يمكن أيضا أن يكون شراؤها من ALA – العلمي. انها مصنوعة من التفلون بولي تترافلوروإيثيلين ولها غشاء واضحة (المفلورة الإثيلين البروبيلين تفلون) تمتد عبر الجزء العلوي. الغشاء يسمح للنشر الغازات ولكن يحد من انتشار المياه وبالتالي القضاء عمليا على ضرورة ترطيب الأجواء ومنع الآثار الضارة للتبخر وفرط الأسمولية 1 بمجرد اكتمال التشريح أعلاه ، هو استمرار شركة طيران الشرق الأوسط من خلال وضع إعداد 100 ميكرولتر من الحل (PEI) polyethyleneimine في مركز كل شركة طيران الشرق الأوسط 13 في أيدينا ، PEI حل يوفر أقل المجموعات من الخلايا في الشرق الأوسط وأفريقيا من استخدام متعدد الليزين. ولا يسمح للطبق على الجلوس في درجة حرارة الغرفة في التدفق الصفحي غطاء لمدة 30 دقيقة مع الأغطية يستريح برفق على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف لمنع التبخر. للتذكير ، فإن أي عمل مع شركة طيران الشرق الأوسط فتح أو أنسجة المخ يحدث في خلية ثقافة معيار غطاء لتدفق الصفحي مصغرةmize من مخاطر التلوث. يتم شطف ثم الشرق الأوسط وأفريقيا 3 مرات مع مل 1-2 المياه غير المتأينة العقيمة. وتدفق الصفحي غطاء مثاليا تشمل انشاء جهاز الشافطة لإزالة السائل من الأطباق. يمكن تركيبها على الحافة ماصة معقمة 200μl لأنابيب الشافطة. لا تلمس سطح الشرق الأوسط وأفريقيا ، بينما الشفط حيث أن هذا يمكن أن تلحق الضرر الأقطاب. بعد شطف النهائي ، يسمح لشركة طيران الشرق الأوسط لتجف لمدة 30 دقيقة على الأقل في تدفق الصفحي هود. خلال هذه الفترة والتجفيف ، وبدأت عملية التفكك العصبية عن طريق وضع قشرات في 2 مل من محلول غراء في 15 مل قنينة بلاستيكية معقمة المخروطية. يضاف 1 50 ميكرولتر من الدناز إلى الخليط. وضعت القنينة في حوض الاستحمام في الماء 35-37 درجة مئوية والمحتضنة لنحو 20 دقيقة. اضغط برفق حل كل 5 دقائق لخلط الحرص على تجنب إدخال الفقاعات. يجب أن نبدأ في اتخاذ القشور على مظهر غامض حيث العائدات الهضم. ثم هو الحل غراء إزالة بعناية من قبل pipetting ترك القشور في قارورة المخروطية في 15ml. يضاف 2 مل من المتوسط ​​الخلية إلى القشور ، سمح لاحتضان لمدة 2-3 دقائق ثم يزال بلطف. هذا هو لغسل أي غراء المتبقية ، والتي سيتم أيضا منعت من مصل الدم في المتوسط. وأضاف آخر 2ml المتوسطة الخلية إلى القشور ، وهذه العينة vortexed ثم على سرعة عالية ل5-10 ثواني. يجب أن يكون هناك حل غائمة في الجزء السفلي من القارورة والمخروطية 15ml الدماغ وليس قطعة المتبقية. يمكن استخدامها بدلا من ذلك ، سحن مع 1 مل من المتوسط ​​بنسبة 3 مرات باستخدام باليد P – 1000 ماصة لعدم الربط بين الأنسجة. (1) للسحن السليم ، كل شوط ماصة ينبغي أن يأخذ ثانية واحدة. ثم يتم السماح لتمرير الحل بلطف من خلال مصفاة الخلية 40μm العقيمة عبر الجاذبية. إضافة ببطء حل الخلية قطرة واحدة في وقت واحد في مصفاة مع P – 1000. وتستخدم 35 ألف طبق بتري معقمة ملم لجمع حل الخلية متوترة. ثم يتم نقل تعليق الخلية مرة أخرى إلى a قنينة مخروطية 15 مل ويضاف إلى خلية متوسطة الحجم النهائي للمل 4.0 (14). ومن ثم 500 ميكرولتر من محلول 5 ٪ BSA ث / ت الطبقات بعناية في الجزء السفلي من القارورة والمخروطية 15ml مع P – 1000 (14). وهذا سوف تحل محل صعودا حل الخلية التي تحتوي في القارورة. ثم يتم طرد الحل زنزانة مع جيش صرب البوسنة في الطبقات السفلى لمدة 6 دقائق في 200 XG لإزالة الحطام صغيرة ومحتويات الخلايا السامة (14). خلال الخلية خطوة الطرد المركزي ، ويتم تقييم بصريا الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف لضمان أن تكون جافة تماما. ثم يتم حل ميكرولتر من 20 laminin وضعت بعناية في وسط الشرق الأوسط وأفريقيا ضمان تغطية كل من الأقطاب الكهربائية. 1 تجنب إدخال فقاعات الهواء إلى هذا الحل منذ ذلك يمكن أن يؤدي إلى عدم كفاية إعداد سطح القطب. إذا كان الشرق الأوسط وأفريقيا لا يجف تماما ، ثم تراجع من laminin المنتشرة في صنع طبق من المحتمل أن يزيد من صعوبة في توطين أكثر من كاف لخلايا الأقطاب عند الطلاء. هذه الخطوة هي حساسة جدا وتنطوي على إمكانية أن تؤدي إلى تلف سطح الشرق الأوسط وأفريقيا مع اهتزاز اليد أو أن تسقط في الاهتمام. يتم وضع أغطية على التفلون في الشرق الأوسط وأفريقيا في هذه المرحلة لمنع تبخر laminin. وضع غطاء أيضا حساسة. يجب فقط ان يتم وضع غطاء أو إزالتها عندما MEA هو على سطح مستو تماما. وإلا ، قد تمارسها قوات اضافية على سطح متفاوتة كسر الزجاج السفلي للصفيف جعلها غير صالحة للاستعمال. ثم يوضع الطبق في الحاضنة لمدة 20 دقيقة. في حين أن laminin غير ملزمة للطبق ، يتم إزالة القارورة التي تحتوي على 15 مل الخلايا المخروطية من أجهزة الطرد المركزي ونقلها إلى الصفحي هود التدفق. وينبغي أن يكون بيليه تكون مرئية في الجزء السفلي من القارورة. تتم إزالة بعناية طاف مع ماصة بلاستيكية معقمة 5ml المصلية. حفظ طاف في حالة عملية الطرد المركزي لم يكن كاملا. هو معلق ثم بيليه إما بلطف مع سحن P – 1000 او دوامة سريعة في المتوسط ​​300-500 ميكرولتر من الخلية اعتمادا على العائد المتوقع. تتم إزالة 10 ميكرولتر التعليق الخلية وضعت على عدادة الكريات لتحديد تركيز الخلية. إذا كانت منخفضة الغلة ، وتحليل طاف تحت المجهر لتحديد ما إذا كان الطرد المركزي خطوة ناقصة. قد يكون من الضروري تكرار الطرد المركزي. إذا كان العائد مرتفع ، ثم قد تكون ضرورية لتخفيف العد أكثر دقة. يمكن أن الخلية كثافة الطلاء تتراوح بين 5،000 و 300،000 الخلايا في الشرق الأوسط وأفريقيا. حساب التخفيف بحيث العدد المطلوب من الخلايا للتصفيح هو في الحجم النهائي للميكرولتر 15-20. نستخدم عادة التركيز النهائي 1000-3000 الخلايا لكل ميكرولتر. وسوف زوج واحد من القشور العائد عادة ما بين 10 و 15 مليون خلية. قد يكون هذا الرقم أقل قليلا إذا استخدمت سحن. قبل هذا الوقت ، رlaminin انه الحضانة على شركة طيران الشرق الأوسط يجب أن يكون كاملا. يتم إزالة الغطاء تفلون من الشرق الأوسط وأفريقيا ومعظم هذا الانخفاض هو laminin فراغ أو يستنشق pipetted بعيدا. ثم يتم على الفور pipetted ميكرولتر 15-20 لتعليق الخلية المطلوبة على منطقة الرطبة المتبقية laminin. نتوخى الحذر لتجنب إدخال فقاعات الهواء في هذا الحجم الصغير للتعليق على الخلية فقاعات الهواء يمكن أن تمنع الخلايا من تغطية بالتساوي كل من الأقطاب الكهربائية. يتم استبدال الغطاء برفق ويوضع بعناية الشرق الأوسط وأفريقيا مرة أخرى في حاضنة لمدة 30 دقيقة. ويتم تفتيش ثم الطبق تحت المجهر الضوء للتأكد من أن الخلايا قد انضمت وتغطية جميع الأقطاب. إذا لم تتم تغطية جميع الأقطاب ، ومن ثم يمكن إضافة المزيد من الخلايا ويتم وضع شركة طيران الشرق الأوسط مرة أخرى في حاضنة مع غطاء للسماح لهذه الخلايا الجديدة على الانضمام. إذا تم استخدام أنبوب التعليق الخلية أكثر من بضع دقائق بعد الجلوس دون عائق ، تأكد من دوامة برفق لتسوية resuspend الخلايا. متى تم تحقيق تغطية كافية الكهربائي ، ثم غمرت المياه ببطء مع طبق من 1ml الدافئة (35-37 درجة مئوية) الخلية المتوسط. يتم استبدال الغطاء تفلون ويوضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة. يمكن للغطاء تدفق الصفحي تجف بسرعة كميات وأحجام صغيرة laminin تعليق الخلية مرة واحدة في الشرق الأوسط وأفريقيا حتى تأخذ الرعاية لإبقائها مغلقة مع الأغطية التفلون. بيئة حاضنة مثالية لالاتفاقات مختومة هو 5 ٪ CO 2 ، O 2 9 ٪ والرطوبة 65 ٪ في 35-37 درجة مئوية. انخفاض توتر الأوكسجين المهم لمدة طويلة الأجل الثقافات ، والحد من الضرر التأكسدي (12). المحافظة على نسبة الرطوبة 65 ٪ يقلل من التبخر من خلال غشاء تفلون (بالمقارنة مع أي سيطرة الرطوبة) ويسمح استخدام الالكترونيات في الشرق الأوسط وأفريقيا الحاضنة دون الاضرار الناجمة عن تكثيف الماء (كما مع حاضنة طبيعية لترطيب تشبع). D. تغيير الخلية المتوسطة ورعاية الثقافات نأت على الاتفاقات في اليوم التالي الطلاء الخلية ، تفقد شركة طيران الشرق الأوسط تحت المجهر الخفيفة. إذا كان لون الخوخ المتوسطة لا تزال إلى الأحمر في اللون ، وهناك كمية محدودة من الحطام الخلوي وموت الخلايا ، ومن ثم يمكن تأجيل التغيير المتوسطة الأولى ليوم آخر. ومع ذلك ، إذا كان المتوسط ​​هو بداية لتبدو أكثر برتقالي أو أصفر اللون و / أو أن هناك كمية كبيرة من الحطام الخلوي وموت الخلايا ، ثم تغيير المتوسط. ينبغي لجميع التغييرات المتوسطة تحدث في خلية ثقافة معيار غطاء تدفق الصفحي. التغيير المتوسطة الأولى تتكون من إزالة الغطاء الشرق الأوسط وأفريقيا ، بعيدا الشفط كافة المتوسطة في الطبق ، ليحل محل المبلغ إزالة المتوسطة مع الخلية الطازجة ، ومن ثم استبدال الغطاء. استبدال كامل المبلغ للوسط الخلية على تغيير المتوسطة الأولى لإزالة أي الحطام المتبقي الخليوي من عملية الطلاء. وينبغي أن التغيرات اللاحقة المتوسطة فقط بعيدا نضح ما يقرب من نصف المتوسط ​​تليها استبدال المبلغ مع إزالة المتوسطة الطازجة. هذا يسمح بعض عوامل النمو التي تفرز في الخلايا المتوسطة في البقاء مع الخلايا الحفاظ على بيئة أكثر الأمثل المتنامية. إذا الملوثة الجانب السفلي من غطاء أثناء عملية تغيير المتوسطة أو إذا كان غطاء يظهر علامات التلف أو فضفاضة ، واستخدام غطاء جديد ثم تعقيمها. ويمكن تخزين المتوسطة الخلية في الحاضنة في حاوية معقمة ذات غطاء مخصصة المعدلة (التي لديها (المفلورة الإثيلين البروبيلين) تفلون الغشاء للسماح للتبادل الغازي). ويمكن أيضا أن يتم تخزين الخلايا المتوسطة في 4 درجات مئوية ولكنه دافئ ويوازن ذلك في حاضنة قبل المتوسطة المتغيرة. إزالة واستبدال ما يقرب من نصف المتوسط ​​في صحن حوالي مرتين في الأسبوع. قد تكون بعض الأعمال التحضيرية الخلية يؤدي إلى تغيير اللون بسرعة أكبر في المدى المتوسط ​​مما تسبب في حاجة إلى المزيد من التغييرات المتكررة. إذا لاحظت أن تكون متوسطة إلى الأصفر ، ثم تغيير كامل المبلغ من المتوسط. ويمكن الانتقال السريع إلى الأصفر يكون أيضا علامة على تلوث بحيث تفقد الطبق تحت المجهر لعلامات الضوء المرئي للعدوى. تبعا للظروف التجريب وتقنية معقمة ، يمكن أن الثقافات التي تم بعناية لرعاية البقاء على قيد الحياة لأكثر من عام. 1 هاء التسجيل من الاتفاقات كل شركة طيران الشرق الأوسط وأقطاب تسجيل 59 واحد القطب الارض الداخلية. هناك العديد من نظم التسجيل التجاري المتاحة ، فضلا عن إصدارات مخصصة المحرز. البائعين وتشمل أنظمة متعددة القنوات ، تاكر تقنيات ديفيس ، أكسيون النظم البيولوجية ، ألفا ميد MED64 العلمية وPlexon ، والنظم البيولوجية Ayanda بيولوجي. مختبرنا يستخدم حاليا على إعداد التجاري متعدد القنوات من الأنظمة ، العرف تصميم Windows نظام قائم يسمى NeuroRighter 15 ، ومصممة خصيصا لينكس نظام قائم يسمى MeaBench 16. كل من هذه الأنظمة قادرة على سجل من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف (متعدد القنوات أنظمة) باستخدام نظم المضخم متعدد القنوات. A الإعداد التجارية من تقنيات ديفيس تاكر هو أيضا قيد الاستخدام. وسوف تثبت تسجيل هذا البروتوكول من الاتفاقات مع NeuroRighter. نيبرنامج uroRighter هو المصدر المفتوح والمتاح للتحميل مجانا جنبا إلى جنب مع التصاميم الأجهزة على الجماعات NeuroRighter جوجل. ( http://sites.google.com/site/neurorighter/ ) الثقافات على الاتفاقات تأخذ 2-3 أسابيع للوصول إلى حالة ثابتة من النشاط. 17،18 ويشمل هذا النشاط إمكانات العمل من تلقاء أنفسهم وثقافة واسعة انفجار (وابلا من إمكانات العمل الذي ينتشر عبر synaptically الثقافة). طبيعة التجربة ستحدد إلا أن العدد المثالي للأيام في المختبر قبل التسجيل. نشاط الخلايا العصبية تعتمد على الظروف البيئية المثالية بما في ذلك درجة الحرارة ودرجة الحموضة 1 ونتيجة لذلك ، لدينا تسجيل يحدث في حاضنة على النحو المبين أعلاه. إذا كانت مصممة تجارب قصيرة (<30 دقيقة) ، وهناك أيضا وحدة التسخين المتاحة تجاريا التي يمكن توصيلها إلى MCS المضخم للحفاظ على درجة حرارة مثالية الشرق الأوسط وأفريقيا. لبدء التسجيل ، يتم نقل بلطف الشرق الأوسط وأفريقيا (لا يزال في طبق بتري والخمسين) من الحاضنة التخزين إلى حاضنة التسجيل. الحفاظ على الجزء السفلي من صحن موازية على الأرض. تجنب الحركات السريعة مع شركة طيران الشرق الأوسط MEA أو التنافر ولأن هذه يمكن فصل الثقافة عن الركيزة. ثم تتم إزالة MEA من طبق بيتري ووضعها في المضخم التسجيل. مباراة القطب الأرض الداخلية في أطباق تظاهرنا حاليا مع القطب الأرض على المضخم (قناة CR15 المضخم للMCS). مسح الاتصالات في جميع أنحاء الشرق الأوسط وأفريقيا محيط باستخدام منديل ورقي أو القطن المبلل مع مسحة من الإيثانول بنسبة 70 ٪ لإزالة بصمات الأصابع أو غيرها من الحطام التي قد تعيق وجود اتصال جيد. بعد التأكد من أن يجلس بشكل صحيح الشرق الأوسط وأفريقيا ، ثم يتم إنزال الغطاء والمضخم في مكان مغلق. ينبغي للاتصالات على الغطاء المضخم بقية بقوة على منصات الاتصال الكهربائي في الشرق الأوسط وأفريقيا. تفقد البصر وضبط المحاذاة الاتصال مع مسحة القطن إذا لزم الأمر. ضع preamp على الجهاز بلتيير في الحاضنة. هذا يتكون من لوحات النحاس اثنين مع حرارة بلتيير مضخة الحرارية الواقعة بينهما. نحن تشغيل هذا في حوالي 5V ، لإزالة بعض من الحرارة التي تنتجها الدوائر preamp. هذا يمنع من تشكيل التكثيف في الداخل غطاء غشاء التفلون. فإن أي إشارة التكثيف تضر الثقافة عن طريق زيادة في الأسمولية من المتوسط ​​في اتصال مع الخلايا ، وذلك بسبب التبخر. عن طريق ضمان أن preamp والمتوسطة هي درجة أو اثنين أقل من درجة حرارة الهواء الحاضنة ، يتم الحد من التغيرات في الأسمولية. بدوره على امدادات الطاقة الى NeuroRighter وفتح البرنامج على محطة العمل. ضبط الإعدادات لNeuroRighter في المختبر مع تكوينات برامج / الجهاز المناسب في المكان أيضا. حدد عدد من الأقطاب الكهربائية في البرنامج. من أجل تقليل كمية من الضوضاء في الخلفية ، يمكن تمكين رقمية الفرقة تمرير التصفية. حدد ملف البيانات مع تبديل إذا سجل في البيانات ليتم حفظها لتحليلها لاحقا. تنشيط زر البدء مرة واحدة ويتم اختيار جميع الإعدادات المناسبة. وينبغي أن تظهر على الشاشة تشغيل آثار النشاط والضوضاء في الخلفية. وينبغي أن إمكانات العمل بين الحين ورشقات نارية صحن واسع من النشاط تكون مرئية. والمقطع أدناه من المشاكل في تسجيل الاتفاقات مناقشة العديد من القضايا المشتركة النشاط المتوقع إذا لم يتم تصوره. يمكن تغيير عرض الشاشة إلى وضع الكشف عن ارتفاع ('SPK Wfms' علامة التبويب) حيث يتم عرض إمكانات عمل ثابت لأنها تحدث في الوقت 3ms النوافذ. عن قناة معينة ، وينبغي أن إمكانات العمل الحقيقي خارج الخلية مشاركة 1ms تقريبا ، وينبغي أن النار مرارا وتكرارا في نفس الاتجاه (إيجابية أو سلبية). أحيانا ، يمكن أن اثنين أو أكثر من الخلايا العصبية واضحة على أن القطب نفسه مع أقطاب مختلفة. التموج مع دورة زمنية قصيرة والتقاطب المتغيرة هي الأداة احتمالا. الشكل 1 يبين مؤامرة من البيانات النقطية الارتفاع. يمكن تغيير عرض الشاشة لامكانات الحقل المحلي (LFPs) لإلقاء نظرة على توطين أصل انفجار النشاط. يمكن لهذا النوع من الإعداد تكون أكثر فائدة عند التسجيل في الجسم الحي منذ الثقافات وLFPs أحادي الطبقة الضعيفة. لاحظ أن بعض preamplifiers (بما في ذلك الاستخدام من احد ونحن متعدد القنوات الأنظمة) وعالية تمرير المرشحات في 10 هرتز والتي سوف تخفف من وتيرة انخفاض إيقاعات LFP. الشبكات العصبية F. حفز على الاتفاقات ويمكن أيضا نفس أقطاب تسجيل 59 شركة طيران الشرق الأوسط على أن تستخدم لتحفيز الثقافة. فإن طبيعة التجربة تحديد مدى التحفيز. NeuroRighter يوفر مرونة لتصميم تجريبي منذ التحفيز فهو مفتوح المصدر رمز 15 التحدي مع تحفيز ثقافة التحفيز هو أن يخلق الأداة التي يمكن أن تستمر عدة ميلي ثانية. وهذا يمكن أن يكون قطعة أثرية كبيرة بما يكفي ليثير تصاعد الكشف والاستجابات التحفيز غامضة. NeuroRighteص يستخدم خوارزمية SALPA للتقليل والقضاء في بعض الحالات أساسا قطعة أثرية التحفيز (19). لتحفيز الخلايا العصبية في شبكة الشرق الأوسط وأفريقيا ، وتدريب الخوارزمية SALPA تحت علامة التبويب "إعدادات التسجيل" للحد من القطع الأثرية التحفيز. تنشيط SALPA في التبويب "إعدادات الإنترنت. تحديد اسم الملف وانقر على زر البدء كما في السابق لبدء التسجيل. ثم انقر على علامة التبويب "Stim. هناك العديد من الخيارات لإعداد التحفيز على هذه الصفحة. تجربة بسيطة لتحفيز one الكهربائي ومراقبة الاستجابة للطبق به قسم "حلقة مفتوحة". تحديد سعر ، والجهد ، مرحلة العرض ورقم القناة. اضغط على زر البدء في المقطع حلقة مفتوحة. يمكن أن الردود على هذا التحفيز يمكن تصور على التبويب الرئيسي "المسامير" وعلامة التبويب "SPK Wfms وتحليلها في ملفات البيانات. في الوقت الحقيقي ، يمكن أن تصور رشقات نارية بطريقة غير الساحلية في الوقت حافزا هيرتز واحدة من 0.5V عبر أقطاب متعددة. ويبين الشكل 2 مؤامرة النقطية للاستجابة ما بعد التحفيز. وقد أثبتت الملاحظات السابقة أن هناك نوعين مختلفين من النشاط التحفيز اثارت : إمكانات العمل أثار مباشرة (DAPS) وإمكانات العمل أثار synaptically (برامج التكيف الهيكلي) 20 الخلايا العصبية في الثقافة ورشقات نارية من النشاط العفوي. بالنسبة لبعض التجارب ، ويمكن لهذا النوع من انفجار تتداخل مع محاولة للسيطرة على ديناميات الشبكة. ومن المثير للاهتمام ، يمكن توزيعها على التحفيز الكهربائي 1-2 هرتز في البداية الى منع انفجار النشاط في الشبكة العصبية على شركة طيران الشرق الأوسط (21). G. حل المشاكل من تسجيل الاتفاقات أي عمل أو إمكانات الحاضر انفجار في شركة طيران الشرق الأوسط عندما يتم تشغيل البرنامج على : هو الثقافة القديمة بما فيه الكفاية؟ وينبغي أن تكون مرئية إمكانات العمل في نهاية الأسبوع الأول في المختبر. انفجار يحدث في جميع أنحاء أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع في المختبر. هو جهاز استقبال السلطة؟ ويستخدم النظام NeuroRighter two 6V بطاريات الرصاص الحمضية الى السلطة في الأجهزة. مفتاح الطاقة يجب أن يكون في الموضع على والبطاريات مشحونة. هي ثقافة حية؟ في بعض الأحيان وهذا يمكن أن يكون تحديا لتحديد كثيفة لا سيما في الثقافة القديمة أو بسبب فرط الخلايا الدبقية. ومع ذلك ، يمكن للمرء أن ينظر للصحة الخلايا العصبية التي تظهر (، لامعة بيضاوية الشكل أجسام الخلايا تحت المجهر النقيض من المرحلة) وسليمة (وليس تجزئة) عمليات الخلية. قد يكون هناك أيضا مشكلة مع الثقافة اذا كانت هناك أدلة مرئية أو للتلوث بسرعة متوسطة المهينة (تصبح حمضية إلا بعد 1-2 أيام بين التغيرات متوسطة). ما هي مقاومة القطب؟ أكثر من استخدامات متعددة ، يمكن للأقطاب الصغرى أو العزل لشركة طيران الشرق الأوسط تتحلل. NeuroRighter لديها القدرة على تقييم مقاومة القطب 15 قراءات مقاومة عادي حول 1kHz ينبغي أن يتراوح بين 10000 و 100000 أوم. أعلى ممانعات توحي يؤدي مكسورة أو الأقطاب الكهربائية وقراءات أقل من 10000 أوم اقتراح العزل تتسرب منها المياه. هو المضخم المتصلة بلوحة الأجهزة؟ يجب أن يكون المضخم كابل الإخراج الذي يربط لوحة الأجهزة. والمضخم أيضا 4 لوحات صغيرة مشجعا أيضا أن تتصل لوحة الأجهزة الرئيسية والهامة للتنشيط فقط. تم تغيير إعدادات NeuroRighter البرامج؟ يجب ضبط تكوين الأجهزة في البرنامج تكون صحيحة لتسجيل للعمل. يمكن تثبيت إصدارات متعددة من المستخدمين تحديث وتغيير إعدادات هذا السبب. هي شركة طيران الشرق الأوسط في 35-37 درجة مئوية؟ انخفاض درجات الحرارة يمكن أن يؤدي إلى انخفاض في النشاط العفوي في الشبكات القشرية. هذه هي عادة ليست قضية منذ تسجيل يحدث داخل الحاضنة المناخ التي تسيطر عليها ، ولكن يجب على المرء أن تسمح لموازنة درجة الحرارة إذا كان الشرق الأوسط وأفريقيا وقد تم خارج الحاضنة لأكثر من بضع ثوان. وقد تم تغيير وسيلة في الساعات القليلة الماضية؟ وقد لاحظنا الثقافات وقف اطلاق النار في كثير من الأحيان لعدة ساعات بعد الرضاعة. لذا ، فمن الأفضل لإجراء التجارب قبل التغذية. القطب مع الضوضاء المفرطة الخلفية تشبع نافذة التسجيل : هو وسيلة الاتصال مع دبوس المضخم الكهربائي على ما يكفي من شركة طيران الشرق الأوسط؟ يمكن أن يكون سبب هذه المشكلة عن طريق دبوس المنحرفة على الغطاء المضخم ، وقطعة صغيرة من القمامة ، وقطرة من المتوسط ​​، على سطح القطب المتدهورة ، أو غشاء تداخل واضح من الغطاء. تفقد الاتصال للحصول على هذه القضايا هي الخطوة الأولى. ويمكن تعديل دبوس مع مسحة القطن غارقة في الايثانول 70 ٪ تحسين الاتصال في بعض الأحيان وخاصة إذا كان هناك انخفاض المتوسط ​​التي تحتاج إلى تنظيف بعيدا. قد تظهر إشارة أسوأ حتى يتبخر الإيثانول. </ لى> لا القطب يبدو أن معطوب؟ يمكن في بعض الأحيان تصور تحت المجهر ضوء الكشف عن تصدع أو حرض العزل الكهربائي مما يؤدي إلى هذا النوع من القطع الأثرية. هي منصات الاتصال البالية أو خدش؟ أحيانا قد يكون هناك عدة اتصالات الكهربائي على شركة طيران الشرق الأوسط التي يصعب على الوجه الأمثل. هذا هو أكثر شيوعا بعد يستخدم MEA متعددة والتصفيح. هل سلك الذهب والمطاط مشربة تجري فقط في اتجاه ل0.5mm سمك ، ويمكن تحسين المضخم الاتصال دبوس مع شركة طيران الشرق الأوسط. هذه المواد متوفرة من Fujipoly ويمكن لطيف لاحتواء الشرق الأوسط وأفريقيا وغطاء. طيران الشرق الأوسط بأكمله يظهر المفرط ضجيج الخلفية : طيران الشرق الأوسط هو في الاتجاه الصحيح وذلك للسماح للقطب الأرض على شركة طيران الشرق الأوسط للاتصال دبوس الأرض على المضخم؟ إذا كانت شركة طيران الشرق الأوسط هو في الاتجاه الصحيح ومن ثم ضمان عدم وجود مشاكل الاتصال الأرضية (2 AC أعلاه) من المهم أيضا النظر فيها. هي قناة CR15 ترتكز بسلك قصيرة إلى الشاسيه preamp؟ قد باستخدام العبور إلى الأرض من خلال المقاومات الداخلية kOhm 30 نتيجة في الضوضاء الزائدة. هل هناك تدخل من الاضواء المحيطة بها ، ومصادر الطاقة أو غيرها من القطع من المعدات؟ واحد من الأشكال الأكثر شيوعا من التدخل هو 60 هرتز من الأضواء والمعدات. يجب أن يكون نظام تسجيل يرتكز بشكل صحيح. يمكن أن تتعرض كابلات التدريع يكون من المفيد أيضا في الحد من التدخل في الخلفية. ممثل النتائج الشكل 1 ، وهذا هو مؤامرة النقطية من 2 دقيقة من النشاط العفوي من شبكة الخلايا العصبية. كل نقطة سوداء يمثل إمكانات العمل. يشار إلى اثنين من رشقات نارية من النشاط مع الأسهم الزرقاء. وردا على أقطاب متعددة هي وظيفة من الاتصال بالشبكة. الشكل 2. هنا هو مؤامرة النقطية من 16 ثانية من النشاط التحفيز أثار. نجوم حمراء تمثل المحفزات. السهام الحمراء سجل خمسة المحفزات التي يسببها بنجاح رشقات نارية من نشاط متشابك عبر أقطاب متعددة. أحيانا ، حافزا لا تسفر عن انفجار ، هنا في السهم الأزرق.