قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي
Summary
هذه المادة سوف بالتفصيل بروتوكول لقياس النشاط calpain في الخلايا الحية باستخدام الثابتة والتدفق الخلوي.
Abstract
Calpains موجودة في كل مكان داخل الخلايا ، والكالسيوم الحساسة ، البروتياز السيستين محايدة<sup> 1</sup>. Calpains تلعب أدوارا حاسمة في العديد من العمليات الفسيولوجية ، بما في ذلك إشارة وإعادة تشكيل هيكل الخلية ، وتنظيم الخلايا الجينات والتعبير وتقدم دورة الخلية<sup> 1</sup>. قد تورطت في الأمراض Calpains ضمور العضلات كثيرة من بينها ، والسرطان والسكري ومرض الزهايمر والتصلب المتعدد<sup> 1</sup>. Calpain تنظيم معقد وغير مفهومة تماما. مرنا والبروتين ربط مستويات ضعيفة للنشاط ، مما يحد من استخدام تقنيات التعبير الجيني أو البروتين لقياس النشاط calpain. تفاصيل هذا البروتوكول فيديو مقايسة تدفق cytometric تطويرها في المختبر لدينا لقياس النشاط calpain في الخلايا الحية والثابتة. يستخدم هذا الأسلوب الركيزة الفلورسنت BOC – LM – تواجه المركز ، الذي هو على وجه التحديد calpain المشقوق ، لقياس النشاط calpain.<sup> 2</sup> في هذا الفيديو ، ويتم قياس النشاط في calpain الثابتة ويعيشون الفئران خلايا اللوكيميا 32Dkit ، وحدها أو كجزء من مجموعة من السكان باستخدام خلية طحالية LSRII دينار بحريني (العلوم البيولوجية). وتظهر الخلايا 32Dkit أن يكون النشاط مرتفعة مقارنة splenocytes العادي.
Protocol
Discussion
وقد تم تحديد النشاط في الخلايا calpain 32Dkit الثابتة والذين يعيشون في هذا البروتوكول الفيديو. أدت المعاملة من خط الخلية مع مثبط calpain PD150606 في تثبيط كامل للنشاط calpain في الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، أدت المعاملة مع مثبط MEK1 PD98059 في تثبيط كامل للنشاط calpain في الخلايا. إرك هو المنشط ا…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بدعم من المنح المقدمة من المعاهد الكندية للأبحاث الصحية ، وسرطان الدم والغدد اللمفاوية والمجتمع في كندا ومؤسسة الليمفوما في كندا.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde |
Invitrogen | Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C |
||
| PD150606 | Invitrogen | Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition. | ||
| PD98059 | Cell Signaling Technology | |||
| AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes |
Invitrogen | |||
| LSR II | BD Bioscience | Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth. |
References
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. . The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).
