Embryo Microinjection: Een techniek om een verbinding in de Zebrafish Yolk te leveren
Published: April 30, 2023
Abstract
Bron: Sorlien, E. L., et al. Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerde gen knock-outs in het modelsysteem Danio rerio. J. Vis. Exp. (2018).
Deze video beschrijft een techniek van Embryo microinjection om verbindingen in Zebrafish dooierzak te leveren.
Protocol
1. Micro-invoeging van CRISPR-componenten in Zebrafish Embryo’s Zet foktanks op de nacht voorafgaand aan het injecteren door het aantal gewenste mannetjes en vrouwtjes (meestal 2 vrouwtjes en 1 of 2 mannetjes) in een kweektank met een scheidingswand op zijn plaats te plaatsen. Bereid een micro-invoegplaat met 1,5% agarose in 1x E3-media (zie tabel met materialen) met 0,01% methyleenblauw (een fungicide) door 35 ml van de gesmolten agarose in een Petrischaal van 10 cm te gieten en leg …
Representative Results
Figuur 1: Vergelijking van de gezondheid van 24 hpf geïnjecteerde embryo’s. Een levend embryo (A) ontwikkeld tot 24 hpf, is gemakkelijk te onderscheiden van een embryo dat de ontwikkeling heeft afgebroken (B). Embryo’s die lijken op (B) of die drastisch zijn veranderd in (A), zoals kromming van de wervelkolom of veranderde hoofd- en oogontwikkeling, moeten uit de schaal worden verwijderd
Materials
| RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. |
|
| E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449 |
|
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
| Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
| Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos | |
| Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
| Incubator | Maintaining embryos at 28.5 C. | ||
| Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long |
| Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles |
| Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
| Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
| Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection | |
| PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. |
Citer Cet Article
Embryo Microinjection: A Technique to Deliver a Compound into the Zebrafish Yolk. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20196, doi: (2023).