Embriyo Mikroenjeksiyon: Zebra Balığı Sarısına Bileşik Teslim Etme Tekniği
Published: April 30, 2023
Abstract
Kaynak: Sorlien, E. L., vd. Model Sistemi Danio rerio’da CRISPR/Cas9 tarafından üretilen Gen Nakavtlarının Verimli Üretimi ve Tanımlanması. J. Vis. Exp. (2018).
Bu videoda, Zebra balığı yumurta sarısı kesesine bileşikler sunmak için Embriyo mikroenjeksiyonunun bir tekniği açıklanmaktadır.
Protocol
1. CRISPR bileşenlerinin Zebra Balığı Embriyolarına Mikroenjeksiyon Enjekte edilmeden önceki gece, istenen erkek ve dişilerin (tipik olarak 2 kadın ve 1 veya 2 erkek) sayısını bir bölücü ile bir üreme tankına yerleştirerek üreme tankları kurun. Erimiş agarozun 35 mL’sini 10 cm Petri kabına dökerek ve hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için kalıba dokunarak çözeltiye kama şeklinde oluklar oluşturmak için hafifçe plastik bir kalıp sererek% 0,01 metilen mavisi (bir m…
Representative Results
Şekil 1: 24 hpf enjekte edilen embriyonun sağlığının karşılaştırılması. 24 hpf’ye kadar geliştirilen canlı bir embriyo (A), gelişimi durdurulan bir embriyodan (B) kolayca ayırt edilir. (B)ye benzeyen veya omurga eğriliği veya değiştirilmiş kafa ve göz gelişimi gibi (A) olarak büyük ölçüde değiştirilmiş özelliklere sahip embriyolar tabaktan çıkarılmalıdır.
Materials
| RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. |
|
| E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449 |
|
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
| Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
| Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos | |
| Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
| Incubator | Maintaining embryos at 28.5 C. | ||
| Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long |
| Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles |
| Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
| Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
| Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection | |
| PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. |
Citer Cet Article
Embryo Microinjection: A Technique to Deliver a Compound into the Zebrafish Yolk. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20196, doi: (2023).