Microiniezione embrionale: una tecnica per consegnare un composto nel tuorlo zebrafish
Published: April 30, 2023
Abstract
Fonte: Sorlien, E. L., et al. Produzione e identificazione efficienti di gene knockout generati da CRISPR/Cas9 nel sistema modello Danio rerio. J. Vis. Exp. (2018).
Questo video descrive una tecnica di microiniezione embryo per fornire composti nel sacco tuorlo Zebrafish.
Protocol
1. Microiniezione di componenti CRISPR in embrioni zebrafish Impostare i serbatoi di riproduzione la notte prima dell’iniezione posizionando il numero di maschi e femmine desiderati (in genere 2 femmine e 1 o 2 maschi) in un serbatoio di riproduzione con un divisore in posizione. Preparare una piastra di microiniezione con 1,5% di agarosio in 1x mezzi E3 (vedi Tabella dei materiali) con blu di metilene allo 0,01% (un fungicida) versando 35 mL dell’agarosio fuso in una piastra di Petri…
Representative Results
Figura 1: Confronto della salute degli embrioni iniettati da 24 HPF. Un embrione vivente (A) sviluppato a 24 hpf, si distingue facilmente da un embrione che ha abortito lo sviluppo (B). Gli embrioni che assomigliano (B) o hanno caratteristiche drasticamente modificate in (A), come la curvatura spinale o lo sviluppo alterato della testa e degli occhi devono essere rimossi dal piatto
Materials
| RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. |
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| E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449 |
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| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
| Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
| Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos | |
| Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
| Incubator | Maintaining embryos at 28.5 C. | ||
| Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long |
| Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles |
| Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
| Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
| Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection | |
| PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. |
Citer Cet Article
Embryo Microinjection: A Technique to Deliver a Compound into the Zebrafish Yolk. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20196, doi: (2023).