Digestione enzimatica e dissociazione manuale: un metodo per preparare embrioni C. elegans per la coltura cellulare
Published: April 30, 2023
Abstract
Fonte: Sangaletti, R. e Bianchi, L. A Metodo per la coltivazione delle cellule embrionali C. elegans. J. Vis. Exp. (2013).
Questo video introduce un metodo per isolare e coltura sterile le cellule embrionali C. elegans in vitro.
Protocol
1. Dissociazione delle cellule embrionali Eseguire i passaggi successivi della procedura in condizioni sterili utilizzando una cappa di flusso laminare. Mentre gli animali sono vestiti su piastre batteriche, i lavaggi e il trattamento con la soluzione di lisi contenente candeggina dovrebbero eliminare la maggior parte se non tutti i batteri. Pertanto, l’utilizzo di una cappa laminare a questo punto della procedura previene la nuova contaminazione della sospensione dell’uovo. Resuspend…
Representative Results
Figura 1. C. embrioni elegani prima e dopo il trattamento con chitinasi. (A) Fotografia delle uova prima dell’esposizione alla chitinasi. La freccia punta al guscio d’uovo trasparente e intatto che circonda un embrione. (B) Uova trattate con chitinasi per 10 minuti. I gusci d’uovo sono stati digeriti e non sono più visibili intorno agli embri…
Materials
| REAGENTS | ||
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN |
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG |
| EQUIPMENT | ||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 |
| 60×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 |
| 100×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 22629883 |
| Laminar Flow Hood | ||
| Inverted Microscope with x10 objective | ||
| Ambient air humidified Incubator |
Citer Cet Article
Enzymatic Digestion and Manual Dissociation: A Method to Prepare C. elegans Embryos for Cell Culture. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20159, doi: (2023).