Análisis eucariotas perfil Polyribosome

1. Preparación de los gradientes de sacarosa 7-47% Prepare gradientes de sacarosa un día antes de su uso para permitir que los gradientes de convertirse en permanente. Hacer estéril el 7% y un 47% las soluciones de sacarosa que contiene 50 mM NH 4 Cl, 50 mM Tris-acetato de pH 7,0 y 12 mm de MgCl 2 y se almacenan a 4 ° C 1. Para 6 gradientes mezcla del 7% y el 47% de sacarosa soluciones madre para 48 ml de cada una de las siguientes concentraciones de sacarosa. Añadir DTT (1M acciones) a cada solución de sacarosa a una concentración final de 1mM. La concentración final 7% de sacarosa 47% de sacarosa 7% 48 mL 0 17% 36 ml 12 ml 27% 24 ml 24 ml 37% 12 ml 36 ml 47% 0 48 mL Con el fin de verter los gradientes, adjunte una pipeta Pasteur a una jeringa de 20 ml de sujeción y cierre con Parafilm o usar una aguja larga. 7 ml de sacarosa al 7% a la parte inferior de 1 x 3.5 "tubo de ultracentrífuga polyallomer. A continuación 7 ml de solución de sacarosa al 17% en la solución de un 7% mediante la colocación de la punta de la pipeta Pasteur cerca del fondo del tubo y la pipeta no mayor a 0.3 mL / seg. Repita con 7 ml cada una de 27%, 37% y 47% soluciones de sacarosa. Usted debe observar las líneas claras entre las capas, lo que indica que un mínimo de mezcla se ha producido. tienda gradientes a 4 ° C durante la noche junto con los discos, botellas de y los tubos que se utilizarán para recoger muestras. 2. Preparación del extracto de levadura Crecen 125 ml de cultivo de levadura a una OD 600 de 0,8 a 1,0. Añadir cicloheximida a la cultura a una concentración final de 100 mg / ml y continuar agitación a 30 ° C durante 15 min. Mientras tanto, preparar un tampón de lisis que contiene 80 mg / ml de cicloheximida, 200 heparina mg / ml, 0,2% DEPC, y 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 30 mM MgCl 2. Mantenga todo en hielo a partir de ahora. Vierta la cultura en una botella de 250 ml de centrífuga y se llenan de hielo. Centrifugar a 8000 xg (7.250 rpm en un rotor de SLA-1500) durante 5 min a 4 ° C. Lavar el sedimento una vez con 10 ml de solución amortiguadora de lisis fría y la transferencia de tubos de 15 ml de polipropileno. Centrifugar a 5900 xg (~ 6000 rpm en un rotor de SLA-600TC) durante 3 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado en 0,5 ml de tampón de lisis, traslado al tubo de 1,5 ml y añadir 0,5 ml de cuentas refrigerados, horno de vidrio lavado con ácido. Vórtice de las células durante cuatro intervalos de 30 segundos, enfriar el tubo en hielo durante 30 segundos entre cada intervalo. Añadir otro 0,5 ml de solución amortiguadora de lisis en el tubo de 1,5 ml. Centrifugar a máxima velocidad en una microcentrífuga (14.000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf 5417R) por 10 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Retire 10 l de un tubo separado para determinar la DO 260 / DO 280 ratio (véase el paso 3.1). Extractos de almacenar a -80 ° C. 3. Preparación de extractos de células de mamíferos Para células adherentes, crecer en un plato de 100 mm hasta la confluencia ~ 70%. Usted necesitará un plato de 100 mm por cada 11 ml de gradiente (rendimiento típico es de ~ 20 OD 260 unidades). Escala de la cantidad lineal para los tamaños de gradiente de mayor o menor. De las células no adherentes, de aproximadamente 1 x 10 7 células son necesarias por gradiente de 11 ml. Antes de la lisis, añadir cicloheximida a 100 mg / ml. Se incuba a 37 ° C durante 15 min. Transferencia de las placas de hielo y lavar las células dos veces en PBS enfriado con hielo. Todos los pasos de futuro debe llevarse a cabo a 0-4 º C. Eliminar todos los rastros de PBS por aspiración (que las placas de drenaje en una cama inclinada de hielo) y añadir una solución amortiguadora de lisis ml, raspar y la transferencia de pre-enfriado tubo de 1,5 ml. Componentes de tampón de lisis tendrá que ser optimizado para el tipo de célula y las condiciones de crecimiento. Un buffer de partida sería de 20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 15 mM MgCl 2, 200 mM KCl, 1% Triton X-100 (v / v), 100 mg / ml de cicloheximida, 2 mM DTT, y 1 mg / ml de heparina. Las variables clave son las concentraciones de magnesio y cloruro de potasio, así como la inclusión o exclusión de los detergentes no iónicos para mejorar la extracción de polisomas obligado citoesqueleto o de la membrana. Lisis de las células, pasando al 27 de aguja de la jeringa de calibre o dos veces por golpes 10.5 de la homogeneización Dounce con el Tipo B maja. La jeringa o un homogeneizador debe ser pre-enfriado antes de su uso. Giran a 14.000 xg durante 5 minutos en microcentrífuga refrigerada. Transferencia de lisado fresco al gradiente de sacarosa (para células de mamíferos esto se hace en tampón de lisis que carecen de Triton X-100 y la heparina, pero de lo contrario como se describe en 1.2 y 1.3) o congelar flash en nitrógeno líquido para su uso posterior. </ol> 4. Centrifugación de gradientes Descongele los lisados ​​polyribosome en el hielo. Determinar la concentración de ácido nucleico en el lisado mediante la adición de la muestra de 10 l reservados a 1 ml de agua y la lectura de la DO 260 / DO 280 relación con un espectrofotómetro. Rendimiento típico de un cultivo de levadura de cerveza cultivada como se describe es de 50 unidades de DO. Con una pipeta con la punta colocada contra la pared del tubo cerca de la superficie de la pendiente, suave capa de 25 OD 260 unidades del lisado en la parte superior de la pendiente. Para un gradiente de 35 ml 500 l de lisado se carga típicamente. Tampón de lisis se puede utilizar para asegurar que todos los gradientes están cargados con un volumen igual. Una cantidad menor de material de mejor rendimiento de resolución. Con unas pinzas, cuidadosamente baje los gradientes en los cubos de un rotor basculante. Centrifugar los gradientes a 100.000 xg (23.000 rpm en un rotor Surespin 630) por 4 horas a 4 ° C. Este protocolo puede ser adaptado para los gradientes de menor volumen. 5. La recopilación de datos y las fracciones Aproximadamente 30 minutos antes de la finalización de la separación de 4 horas coloque la aguja de la perforación del tubo Modelo 184. Coloque el lápiz a la línea de modelo Isco UA-5 Absorbancia / Monitor de fluorescencia. Encienda el monitor de absorción para permitir que una línea de base estable para ser alcanzado antes de analizar las muestras. Electrónicos para la adquisición del perfil de polisomas se puede obtener fácilmente por colocar un dispositivo de DI-148U de adquisición de datos (DATAQ Instruments) para el registro gráfico. Perfiles se puede recoger en tiempo real y se guarda para su posterior anotación usando el software que acompaña WinDaq. Llene la bomba de jeringa con 50 ml de Fluorinert utilizando el flujo inverso, de fraguado rápido. Asegúrese de que no hay burbujas de aire. Conecte la manguera de la jeringa en el tubo de perforación y brevemente a su vez en el flujo de Fluorinert a 3 ml / min en dirección hacia adelante para despejar el tubo de burbujas de aire. Coloque un vaso de residuos o una serie de tubos de recogida de las fracciones, si debajo de la manguera en el extremo de la celda de flujo para recoger la muestra corriendo. Retire con cuidado los tubos de centrifugación polyallomer que contiene el gradiente de sacarosa del rotor de la centrífuga y colocarlos en hielo (pre-forma de los pozos en el hielo con un tubo de vacío para evitar gradientes inquietante). Para el análisis de extractos celulares, se coloca el tubo de gradiente en la perforación del tubo. Conecte la parte superior del tubo a la toma y seguro. Levante la etapa final para el tubo de centrífuga de modo que la aguja perfora el fondo del tubo. Una vez que la aguja ha sobresalido a través de la parte inferior del tubo de centrífuga, iniciar el flujo de Fluorinert en la dirección de avance en 6mL/min. Una vez que el Fluorinert ha comenzado a fluir en el tubo, vigilar el movimiento de la aguja en el monitor de la absorbancia en línea. Una vez que la aguja comienza a moverse, a su vez en el movimiento gráfico a un ajuste de velocidad de 60. El monitor medirá el diámetro exterior 254 a partir del material libre seguido por la detección de la subunidad ribosómica 40S y continuando a través de complejos polyribosome. Si usted está recogiendo fracciones de ARN o el análisis de proteínas, por lo general 0,2 min se toman fracciones (1 ml). Para el análisis de ARN, las fracciones se deben recoger directamente en tubos con Trizol (Invitrogen), fenol o K SDS / proteinasa, dependiendo del método preferido de extracción. Cuando el extremo del perfil polyribosome se ha alcanzado, a su vez el flujo de Fluorinert al tubo de centrífuga y detener el movimiento de la tabla de absorbancia / monitor de fluorescencia. Retraer el Fluorinert desde el tubo de centrífuga con la jeringa de inicio del flujo en la dirección contraria a gran velocidad teniendo cuidado de no extraer la sacarosa de la sonda en la jeringa. Desenroscar el tubo de centrífuga de la perforación del tubo, bajar la aguja, y retirar el tubo. Repita los pasos 5.5 a 5.8 por cada gradiente de sacarosa. Cuando todos los gradientes de sacarosa se han analizado, retraer el Fluorinert de la manguera en la jeringa. Retire cada parte del fraccionador (perforación del tubo y la celda de flujo), incluyendo la manguera de residuos situado en la parte superior y enjuague bien con agua. 6. Resultados representante Figura 1. Rastro Representante de extracto de ribosoma preparada con la cepa de levadura BY4741 (una estera his3 Δ Δ 0 1 leu2 met15 Δ 0 ura3 Δ 0) en presencia de cicloheximida. El extracto fue fraccionado ribosomal utilizando un gradiente de sacarosa 7 47% y se analizaron mediante un aparato de bomba de jeringa conectada a un detector de UV. Picos que contienen polirribosomas y 80S, 60S y 40S ribosomas se indican.