Эукариотические Polyribosome Анализ профиля

1. Подготовка 7-47% сахарозы градиенты Подготовка сахарозы градиенты за один день до использования, чтобы градиенты, чтобы стать непрерывным. Сделать стерильный 7% и 47% сахарозы растворов, содержащих 50 мМ NH 4 Cl, 50 мМ Трис-ацетат 7,0 рН и 12 мм MgCl 2 и хранить при температуре 4 ° C 1. За 6 градиенты смесь 7% и 47% растворы сахарозы акции, чтобы сделать 48 мл каждого из следующих концентрациях сахарозы. Добавить DTT (1M акций) для каждого раствора сахарозы в конечной концентрации 1 мМ. Конечная концентрация 7% сахарозы 47% сахарозы 7% 48 мл 0 17% 36 мл 12 мл 27% 24 мл 24 мл 37% 12 мл 36 мл 47% 0 48 мл Для того, чтобы залить градиентами, приложите пипетки Пастера в 20 мл шприца, обеспечивая и герметизации с парафильмом или использовать длинную иглу. Добавить 7 мл 7% сахарозы в нижней части 1 х 3,5 "трубки ультрацентрифуге polyallomer. Затем добавьте 7 мл 17% раствора сахарозы под 7%-ный раствор, помещая кончик пипетки Пастера возле нижней части трубки и пипетки не быстрее, чем на 0,3 мл / сек. Повторите с 7 мл каждый из 27%, 37% и 47% растворы сахарозы. Вы должны наблюдать четких разграничений между слоями, что указывает на минимальное смешение произошло. Магазин градиентов при 4 ° С в течение ночи вместе с роторами, бутылки и трубы, которые будут использоваться для сбора образцов. 2. Подготовка дрожжевой экстракт Рост 125 мл дрожжевой культуры OD 600 из 0,8-1,0. Добавить циклогексимид к культуре до конечной концентрации 100 мкг / мл и сотрясают при температуре 30 ° С в течение 15 мин. Между тем, подготовка лизис буфера, содержащего 80 мкг / мл циклогексимид, 200 мкг / мл гепарина, 0,2% DEPC и 10 мМ Трис-HCl рН 7,5, 0,1 М NaCl, 30 мм MgCl 2. Держите все на льду, с этого момента. Налейте культуры в 250 мл бутылки центрифуги и залить лед. Центрифуга в 8000 мкг (7250 оборотов в минуту в SLA-1500 ротора) в течение 5 мин при 4 ° C. Вымойте гранул раз с 10 мл ледяной буфера для лизиса и передачи до 15 мл трубы полипропилен. Центрифуга на 5900 мкг (~ 6000 оборотов в минуту в SLA-600TC ротора) в течение 3 мин при 4 ° C. Ресуспендируют гранулы в 0,5 мл лизирующего буфера, трансфер до 1,5 мл трубки и добавить 0,5 мл охлажденной, запеченные кислотой мыть стеклянные бусы. Vortex клетки в течение четырех каждые 30 сек, охлаждение трубки на льду в течение 30 секунд между каждым интервалом. Добавить еще 0,5 мл лизис буфера в 1,5 мл трубки. Центрифуга с максимальной скоростью в микроцентрифужных (14000 оборотов в минуту в микроцентрифужных Eppendorf 5417R) в течение 10 мин при 4 ° C. Передача супернатант в новую трубку микроцентрифужных 1,5 мл. Удалить 10 мкл в отдельную трубку, чтобы определить диаметр 260 / 280 OD отношение (см. шаг 3.1 ниже). Магазин экстрактов при температуре -80 ° C. 3. Подготовка выписки из клеток млекопитающих Для прилипшие клетки, растут в 100 мм блюдо до ~ 70% слияния. Вам понадобится один 100 мм блюдо за 11 мл градиент (типичный выход ~ 20 OD 260 единиц). Шкала количество линейно для большего или меньшего размера градиента. Для не прилипшие клетки, примерно 1 х 10 7 клеток необходимы в 11 мл градиента. До лизис, добавьте циклогексимид до 100 мкг / мл. Инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин. Передача пластины льда и промыть клетки дважды в ледяной PBS. Все последующие шаги должны выполняться при 0-4 ° C. Удалите все следы PBS стремлением (пусть пластин утечке угловой кровати льда) и добавьте 1 мл лизирующего буфера, лом и передачи предварительно 1,5 мл охлажденной трубки. Лизис компонентов буфера должны быть оптимизированы для типа клеток и условий роста. Хорошая отправная буфера составит 20 мМ HEPES-KOH, рН 7,4, 15 мМ MgCl 2, 200 мМ KCl, 1% Тритон Х-100 (об. / об), 100 мкг / мл циклогексимид, 2 мМ DTT, и 1 мг / мл гепарина. Ключевых переменных концентраций магния и хлористого калия, а также включение или исключение неионогенные моющие средства для улучшения извлечения цитоскелета или мембраносвязанных полисом. Lyse клетки, проходя через иглу шприца 27 калибр в два раза или на 5-10 ударов Dounce гомогенизации использованием типа B пестиком. Шприца или гомогенизатор должны быть предварительно охлажденной до использования. Спиновые при 14000 мкг в течение 5 мин в охлажденном микроцентрифужных. Передача свежего лизата в градиенте сахарозы (для клеток млекопитающих это сделано в буфере для лизиса не хватает Тритон Х-100 и гепарина, но в остальном, как описано в 1.2 и 1.3) или флэш-заморозить в жидком азоте для последующего использования. </ol> 4. Центрифугирование градиентов Оттепель polyribosome лизатов на льду. Определение концентрации нуклеиновых кислот в лизат, добавив защищены 10 мкл образца к 1 мл воды и чтение OD 260 / OD 280 соотношении с спектрофотометр. Типичный выход из дрожжевая культура выращивается, как описано в 50 единиц ОП. Использование пипетки с наконечником помещается на стенку трубки вблизи поверхности градиента, мягко слой 25 OD 260 единиц лизат поверх градиента. Для 35 мл градиент 500 мкл лизата, как правило, загружены. Лизис буфер может быть использован для обеспечения всех градиентов загружаются с равным объемом. Нижняя количество материала доходность лучшего разрешения. Использование щипцов, осторожно опустите градиенты в ведра размахивая ведром ротора. Центрифуга градиенты на 100 000 мкг (23 000 оборотов в минуту в Surespin 630 ротора) в течение 4 часов при температуре 4 ° C. Этот протокол может быть адаптирован для небольших градиентов объема. 5. Сбор данных и фракций Примерно за 30 мин до окончания 4 часа спина приложить иглой Модель 184 пирсингу трубки. Прикрепите перо онлайн Модель Isco UA-5 Поглощение / Флуоресцентный монитор. Включите поглощения монитора позволяют стабильной базовой которые должны быть достигнуты до анализа образцов. Электронные приобретение polysome профиль может быть легко получены путем присоединения DI-148U устройство сбора данных (DATAQ Instruments) для самописца. Профили могут быть собраны в режиме реального времени и сохранять для последующего использования аннотации сопутствующего программного обеспечения WinDaq. Заполните шприц насос с 50 мл Fluorinert использованием обратного потока, быстрой настройки. Убедитесь в том, что Есть нет воздушных пузырей настоящее время. Подключить шланг от шприца в трубку пирсингу и кратко остановиться на поток Fluorinert в 3 мл / мин в прямом направлении, чтобы очистить шланг любые воздушные пузыри. Место стакан отходов или ряд труб, если сбор фракций под шланг в конце проточной ячейки для сбора образцов убежал. Осторожно снимите polyallomer центрифуги пробирки, содержащие сахарозу градиентом от ротора центрифуги и разместить их на лед (преформ скважин во льду с пустой трубкой чтобы не потревожить градиентов). Для анализа клеточных экстрактов, место градиент трубки на трубку пирсингу. Подключите верхней части трубки к розетке и безопасно. Поднимите нижнюю ступень в центрифуге трубку так, что игла пробивает нижнюю часть трубки. Как только игла торчала через дно центрифужной пробирке, начинают поток Fluorinert в прямом направлении на 6mL/min. После Fluorinert начался впадающих в трубку, контролировать движение иглы на онлайн-мониторинг абсорбции. Как только игла начинает двигаться, поворот на графике движения скорость установки 60. Монитор будет записывать OD 254, начиная с материал без последующей 40S рибосомальной субъединицей обнаружения и продолжающейся до polyribosome комплексов. Если вы собираете фракций для РНК или белка анализа, как правило, 0,2 мин фракции принимаются (1 мл). Для анализа РНК, фракции должны быть собраны непосредственно в пробирки, содержащие Trizol (Invitrogen), фенол или SDS / протеиназы К, в зависимости от предпочтительного метода добычи. Когда в конце polyribosome профиля не было достигнуто, выключить поток Fluorinert на центрифуге трубки и остановить график движения поглощения / флуоресценции монитора. Уберите Fluorinert из центрифуги трубки в шприц, начав поток в обратном направлении с большой скоростью убедившись, что не обратить сахарозы из трубки в шприц. Отвинтите центрифуге трубки из трубки пирсингу, нижняя игла, и снимите трубку. Повторите шаги 5.5 через 5,8 для каждой градиенте сахарозы. Когда все сахарозы градиенты, были проанализированы, отказаться от Fluorinert шланг обратно в шприц. Удалите каждую часть ректификационной колонны (пирсингу трубки и проточную ячейку), включая отходы шланга, расположенные в верхней и хорошо промыть водой. 6. Представитель Результаты Рисунок 1. Представителю следов рибосомы экстракт готовят из штамма дрожжей BY4741 (матовая his3 Δ 1 leu2 Δ 0 met15 Δ 0 URA3 Δ 0) в присутствии циклогексимид. Рибосомных экстракт фракционированного использованием 7 47% сахарозы градиента и анализировали с помощью аппарата насос шприца придает УФ-детектор. Пики содержащие полирибосом и 80S, 60S и 40S рибосомы указаны.