Análise de Perfil eucarióticas Polyribosome

1. Preparação de gradientes de sacarose 7-47% Prepare gradientes de sacarose um dia antes do uso para permitir gradientes para tornar-se contínuo. Tornar estéril 7% e soluções de sacarose 47% contendo 50 mM NH 4 Cl, 50 mM Tris pH 7,0 Acetato e MgCl 2 12mm e armazenar a 4 ° C 1. Por 6 gradientes misturar os 7% e as soluções estoque 47% de sacarose para fazer 48 mL de cada uma das seguintes concentrações de sacarose. Adicionar TDT (1M estoque) para cada solução de sacarose a uma concentração final de 1mM. Concentração Final Sacarose 7% 47% de sacarose 7% 48 mL 0 17% 36 mL 12 mL 27% 24 mL 24 mL 37% 12 mL 36 mL 47% 0 48 mL , A fim de derramar os gradientes, anexar uma pipeta Pasteur a uma seringa de 20 mL de segurança e vedação com Parafilm ou usar uma agulha longa. Adicionar 7 ml de sacarose 7% para o fundo de um tubo de 1 x 3,5 ultracentrífuga "polyallomer. Em seguida adicione 7 mL da solução de sacarose 17% sob a solução de 7%, colocando a ponta da pipeta Pasteur perto fundo do tubo e pipetar não mais do que 0,3 mL / sec Repetir. com 7 mL cada de 27%, 37% e soluções de sacarose 47%. Você deve observar linhas claras entre as camadas, indicando que a mistura mínima ocorreu. loja gradientes a 4 ° C durante a noite junto com os rotores, garrafas e tubos que serão utilizados na colheita de amostras. 2. Preparação do extrato de levedura Crescer 125 mL de cultura de levedura para um OD 600 de 0,8-1,0. Adicionar cicloheximida para a cultura a uma concentração final de 100 mcg / mL e continuar apertando a 30 ° C por 15 min. Enquanto isso, prepare tampão de lise contendo 80 mcg / mL cicloheximida, 200 heparina mcg / mL, DEPC 0,2%, e 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 30mm MgCl 2. Mantenha tudo no gelo a partir deste ponto. Despeje a cultura em um frasco de centrífuga de 250 mL e encha com gelo. Centrifugar a 8000 xg (7.250 rpm em um rotor SLA-1500) por 5 min a 4 ° C. Lave o pellet uma vez com 10 mL de tampão de lise de gelo frio e transferência para tubos de 15 mL de polipropileno. Centrifugar a 5900 xg (~ 6.000 rpm em um rotor SLA-600TC) por 3 min a 4 ° C. Ressuspender o sedimento em 0,5 mL de transferência de tampão de lise, para tubo de 1,5 ml e adicionar 0,5 mL de refrigerados, cozido contas ácido lavado vidro. Vortex as células para quatro intervalos de 30 segundos, resfriando o tubo em gelo durante 30 segundos entre cada intervalo. Adicionar uma outra de 0,5 mL de tampão de lise no tubo de 1,5 mL. Centrifugar a velocidade máxima em microcentrífuga (14.000 rpm em uma microcentrífuga Eppendorf 5417R) por 10 min a 4 ° C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Retire 10 ml para um tubo separado para determinar a OD 260 / OD 280 ratio (veja o passo 3.1). Extratos armazenar a -80 ° C. 3. Preparação de extratos de células de mamíferos Para células aderentes, crescer em 100 prato mm a confluência ~ 70%. Você vai precisar de um prato de 100 mm por 11 gradiente ml (rendimento típico é ~ 20 OD 260 unidades). Escala a quantidade linearmente para tamanhos gradiente maior ou menor. Para as células não aderentes, cerca de 1 x 10 7 células são necessárias por 11 ml de gradiente. Antes de lise, adicione cicloheximida a 100 mcg / mL. Incubar a 37 ° C por 15 min. Transferência de placas de gelo e lave as células duas vezes em PBS gelado. Todos os passos futuros deve ser realizado em 0-4 ° C. Remover todos os vestígios de PBS por aspiração (vamos placas de drenagem em uma cama em ângulo de gelo) e adicionar 1 mL tampão de lise, raspar e transferência para pré-refrigerados tubo de 1,5 mL. Componentes do tampão de lise terá de ser otimizado para o tipo de célula e as condições de crescimento. Um buffer bom começo seria de 20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 15 mM MgCl 2, 200 mM KCl, 1% Triton X-100 (v / v), 100 mcg / mL cicloheximida, 2 mM DTT e 1 mg / heparina mL. As variáveis-chave são as concentrações de magnésio e cloreto de potássio, bem como a inclusão ou exclusão de detergentes não-iônicos para melhorar a extração do citoesqueleto ou membrana polissomos ligados. Lisar células, passando por 27 gauge agulha da seringa ou duas vezes por golpes de homogeneização 10/05 Dounce usando Tipo B pilão. A seringa ou homogeneizador deve ser pré-refrigerado antes de usar. Giram a 14.000 xg por 5 min em microcentrífuga refrigerada. Transferência lisado fresco para o gradiente de sacarose (para células de mamíferos esta é feita em tampão de lise falta Triton X-100 e heparina, mas de outra forma, como descrito em 1.2 e 1.3) ou congelar flash em nitrogênio líquido para uso posterior. </ol> 4. Centrifugação de gradientes Descongelar lisados ​​polyribosome no gelo. Determinar a concentração de ácido nucléico na lisado, adicionando a amostra de 10 mL reservados a 1 mL de água e leitura do OD 260 / 280 OD relação com um espectrofotômetro. Rendimento típico de uma cultura de leveduras cultivadas como descrito é de 50 unidades de OD. Com uma pipeta com a ponta colocado contra a parede do tubo perto da superfície do gradiente, gentilmente camada de 25 OD 260 unidades do lisado no topo do gradiente. Para um gradiente de 35 mL 500 mL de lisado é normalmente carregado. Lise pode ser usado para garantir a todos os gradientes são carregados com um volume igual. Menor quantidade de material resultam em melhor resolução. Utilizando uma pinça, cuidadosamente inferior os gradientes em baldes de um rotor de caçamba móvel. Centrifugar os gradientes de 100.000 xg (23.000 rpm em um 630 Surespin rotor) por 4 horas a 4 ° C. Este protocolo pode ser adaptado para gradientes de menor volume. 5. Recolha de dados e frações Cerca de 30 min antes da conclusão do spin hr 4 anexar a agulha para a piercer tubo Modelo 184. Anexar a caneta para o modelo on-line Isco UA-5 Absorbância / Monitor de fluorescência. Poder sobre a absorbância monitor para permitir uma linha de base estável para ser alcançado antes de amostras. Aquisição eletrônica do perfil polysome pode ser facilmente obtido anexando um DI-148U unidade de aquisição de dados (DATAQ Instruments) para o registrador gráfico. Os perfis podem ser coletados em tempo real e guardado para mais tarde anotação usando o software que acompanha WinDaq. Encha a bomba de seringa com 50 ml de Fluorinert usando o fluxo reverso, a definição rápida. Certifique-se que não há bolhas de ar. Ligue a mangueira da seringa para o piercer tubo e brevemente ligar o fluxo de Fluorinert a 3 mL / min para a frente para limpar a mangueira de bolhas de ar. Coloque um copo de resíduos ou de uma série de tubos de coleta de frações se sob a mangueira no final da célula de fluxo para coletar amostra de fugir. Remova cuidadosamente os tubos polyallomer centrífuga contendo o gradiente de sacarose de rotor de centrífuga e colocá-los no gelo (pré-forma os poços no gelo com um tubo vazio para evitar gradientes de perturbação). Para analisar extratos de células, coloque o tubo de gradiente na piercer tubo. Conecte o topo do tubo à saída e seguro. Elevar o estágio inferior para o tubo de centrifugação, para que a agulha perfura o fundo do tubo. Uma vez que a agulha se projetava através do fundo do tubo de centrifugação, comece o fluxo de Fluorinert na direção para frente na 6mL/min. Uma vez que o Fluorinert começou fluir para dentro do tubo, monitorar o movimento da agulha no monitor absorbância online. Uma vez que a agulha começa a se mover, girar sobre o movimento gráfico para um ajuste de velocidade de 60. O monitor irá gravar o OD 254 começando com o material livre seguido por subunidade ribossômica 40S detecção e continuando até aos complexos polyribosome. Se você está coletando frações de RNA ou análise de proteínas, tipicamente 0,2 min frações são tomadas (1 mL). Para a análise de RNA, as frações devem ser coletadas diretamente em tubos contendo Trizol (Invitrogen), fenol ou SDS / proteinase K, dependendo do método preferido de extração. Quando o fim do perfil polyribosome foi alcançado, desligue o fluxo de Fluorinert para o tubo de centrifugação e parar o movimento gráfico da absorbância / monitor de fluorescência. Retrair o Fluorinert do tubo de centrifugação para a seringa, começando o fluxo no sentido inverso a uma taxa rápida tomando cuidado para não chamar a sacarose do tubo para dentro da seringa. Tubo de desapertar a centrífuga do piercer tubo, menor a agulha, e retire o tubo. Repita os passos 5,5 por 5,8 para cada gradiente de sacarose. Quando todos os gradientes de sacarose foram analisados, recolher o Fluorinert da mangueira para dentro da seringa. Retire cada parte do fraccionamento (piercer tubo e célula de fluxo), incluindo a mangueira de resíduos localizados na parte superior e enxaguar bem com água. 6. Resultados representante Figura 1. Trace Representante do extrato ribossomo preparados a partir de cepa de levedura BY4741 (mat um his3 Δ Δ 0 1 leu2 met15 Δ 0 Δ ura3 0) na presença de cicloheximida. O extrato foi fracionado ribossomal utilizando um gradiente de sacarose 7 47% e analisados ​​utilizando um aparelho de bomba de seringa conectada a um detector UV. Picos contendo polirribossomos e 80S, 60S e 40S ribossomos são indicados.