Eucaryotes Analyse du profil polyribosome

1. Préparation des gradients de sucrose 7-47% Préparer des gradients de sucrose un jour avant l'utilisation pour permettre aux gradients de devenir permanente. Faire stériles 7% et 47% de saccharose des solutions contenant 50 mM de NH 4 Cl, 7,0 50mM pH Tris-Acétate et 12mm MgCl 2 et stocker à 4 ° C 1. Pour 6% des gradients de mélanger les 7 et 47% de saccharose solutions de stock pour faire 48 ml de chacune des concentrations de saccharose suivantes. Ajouter la TNT (1M stock) à chaque solution de saccharose à une concentration finale de 1 mM. Concentration finale 7% de saccharose 47% de saccharose 7% 48 ml 0 17% 36 ml 12 ml 27% 24 ml 24 ml 37% 12 ml 36 ml 47% 0 48 ml Afin de verser les gradients, joignez une pipette Pasteur pour une seringue de 20 ml par la sécurisation et d'étanchéité avec Parafilm ou l'utilisation d'une aiguille longue. Ajouter 7 ml de saccharose à 7% au fond d'un 1 x 3.5 "tube d'ultracentrifugation polyallomère. Suivant ajouter 7 ml de solution de saccharose 17% dans la solution de 7% en plaçant la pointe pipette Pasteur près du fond du tube et de pipetage pas plus vite que 0,3 ml / sec. Répéter avec 7 ml chacun de 27%, 37% et des solutions de saccharose de 47%. Vous devez respecter les lignes claires entre les couches, ce qui indique que le mélange minimale est survenue. gradients de magasin à 4 ° C pendant la nuit avec les rotors, les bouteilles et des tubes qui seront utilisés pour récolter des échantillons. 2. Préparation de l'extrait de levure Cultivez 125 ml de culture de levure à une DO 600 de 0,8 à 1,0. Ajouter cycloheximide à la culture à une concentration finale de 100 pg / ml et continuer agitation à 30 ° C pendant 15 min. Pendant ce temps, préparer un tampon de lyse contenant 80 pg / ml de cycloheximide, 200 pg / ml d'héparine, DEPC 0,2%, et 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M de NaCl, 30 mM MgCl 2. Gardez tout sur la glace à partir de ce point. Verser la culture dans un flacon de 250 ml à centrifuger et remplir de glace. Centrifuger à 8000 xg (7250 rpm dans un rotor SLA-1500) pendant 5 min à 4 ° C. Laver le culot une fois avec 10 ml de tampon de lyse de la glace froide et le transfert des tubes de 15 ml en polypropylène. Centrifuger à 5900 xg (~ 6000 rpm dans un rotor SLA-600TC) pendant 3 min à 4 ° C. Reprendre le culot dans 0,5 ml de tampon de lyse, le transfert au tube 1.5ml et ajoutez 0,5 ml d'réfrigérés, cuits perles de verre lavée à l'acide. Vortex les cellules pour des intervalles de quatre secondes 30, le tube de refroidissement sur la glace pendant 30 secondes entre chaque intervalle. Ajouter une autre dose de 0,5 mL de tampon de lyse dans le tube de 1,5 ml. Centrifuger à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse (14 000 rpm dans un microcentrifugeuse Eppendorf 5417R) pendant 10 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml microtubes. Retirer 10 ul d'un tube séparé pour déterminer la DO 260 / DO 280 Ratio (voir l'étape 3.1 ci-dessous). Extraits Conserver à -80 ° C. 3. Préparation des extraits de cellules de mammifères Pour les cellules adhérentes, grandir en 100 mm à plat confluent ~ 70%. Vous aurez besoin d'un plat de 100 mm par 11 ml de gradient (rendement typique est d'environ 20 260 unités OD). Échelle du montant linéairement pour des tailles plus grandes ou plus petites gradient. Pour des cellules non adhérentes, soit environ 1 x 10 7 cellules sont nécessaires par 11 ml de gradient. Avant de lyse, ajouter cycloheximide à 100 pg / mL. Incuber à 37 ° C pendant 15 min. Transfert des plaques de glace et rincer les cellules à deux reprises en PBS glacé. Toutes les étapes futures doivent être effectuées à 0-4 ° C. Enlevez toutes les traces de PBS par aspiration (laissez égoutter les plaques sur un lit d'angle de la glace) et ajouter 1 ml de tampon de lyse, gratter et transfert à l'avant-tube de 1,5 ml refroidi. Composants du tampon de lyse devra être optimisé pour le type de cellule et des conditions de croissance. Un tampon de départ serait de 20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 15 mM MgCl2, 200 mM de KCl, 1% de Triton X-100 (v / v), 100 ug / ml de cycloheximide, 2 mM de DTT, et 1 mg / ml d'héparine. Les principales variables sont les concentrations de magnésium et de chlorure de potassium ainsi que l'inclusion ou l'exclusion de détergents non ioniques afin d'améliorer l'extraction du cytosquelette ou membrane polysomes liés. Lyse des cellules en passant à travers 27 aiguille de la seringue de calibre double ou par coups de 5-10 homogénéisation Dounce de type B en utilisant un pilon. La seringue ou homogénéisateur doit être pré-refroidis avant utilisation. Centrifuger à 14000 xg pendant 5 min dans microcentrifugeuse réfrigérés. Transfert lysat frais au gradient de saccharose (pour les cellules de mammifères présente est constitué de tampon de lyse manque de Triton X-100 et l'héparine mais autrement comme décrit dans 1.2 et 1.3) ou geler éclair dans l'azote liquide pour une utilisation ultérieure. </ol> 4. La centrifugation de gradients Dégel lysats polyribosomes sur la glace. Déterminer la concentration d'acide nucléique dans le lysat en ajoutant l'échantillon de 10 uL réservés à 1 mL d'eau et de lecture de la DO 260 / DO 280 ratio avec un spectrophotomètre. Rendement typique d'une culture de levures cultivées comme décrit est de 50 unités de DO. Avec une pipette avec la pointe placée contre le mur du tube près de la surface de la pente, doucement couche 25 DO 260 unités du lysat sur ​​le haut de la pente. Pour un gradient de 35 500 ml de lysat est habituellement chargé. Tampon de lyse peut être utilisé pour assurer tous les dégradés sont chargés avec un volume égal. Basse quantités de matière de rendement meilleure résolution. En utilisant des pinces, soigneusement bas les gradients dans des seaux d'un rotor swing. Centrifuger les gradients à 100.000 xg (23 000 rpm dans un rotor de 630 Surespin) pendant 4 heures à 4 ° C. Ce protocole peut être adapté pour des gradients de plus petit volume. 5. Collecte des données et des fractions Environ 30 min avant la fin de la rotation de 4 heures à fixer l'aiguille le perceur tube modèle 184. Attacher le stylo pour le modèle en ligne Isco UA-5 Absorbance / Monitor fluorescence. Puissance sur l'absorbance suivre pour permettre à une base stable pour être atteint avant l'analyse des échantillons. Électroniques pour l'acquisition du profil de polysomes peut facilement être obtenue en attachant une unité DI-148U acquisition de données (DATAQ Instruments) à l'enregistreur graphique. Les profils peuvent ensuite être collectées en temps réel et sauvegardés pour plus tard en utilisant le logiciel d'annotation WinDaq accompagnement. Remplir la pompe seringue avec 50 ml de Fluorinert utilisant le flux inverse, à prise rapide. Assurez-vous qu'il n'ya pas de bulles d'air présentes. Raccordez le tuyau de la seringue pour le perceur tube et mettez brièvement sur les flux de Fluorinert à 3 mL / min dans le sens avant d'effacer le tuyau d'éventuelles bulles d'air. Placer un bécher de déchets ou une série de tubes si la collecte de fractions sous le tuyau à l'extrémité de la cellule de flux pour recueillir l'échantillon de ruissellement. Retirer délicatement les tubes à centrifuger polyallomère contenant le gradient de saccharose de rotor de la centrifugeuse et les placer sur la glace (pré-former des puits dans la glace avec un tube vide pour éviter de perturber les gradients). Pour analyser des extraits de cellules, placer le tube de gradient sur le pierceur tube. Branchez le haut du tube à la sortie et sécurisé. Soulever l'étage inférieur du tube de centrifugation afin que l'aiguille perce le fond du tube. Une fois l'aiguille dépassait de la partie inférieure du tube de centrifugation, amorcer l'écoulement de Fluorinert dans le sens direct au 6mL/min. Une fois le Fluorinert a commencé coule dans le tube, de surveiller le mouvement de l'aiguille sur le moniteur d'absorbance en ligne. Une fois que l'aiguille commence à se déplacer, tourner sur le mouvement graphique à un réglage de la vitesse de 60. Le moniteur enregistre la DO 254 en commençant par le matériel gratuitement suivie par la détection sous-unité ribosomale 40S et en continuant par le biais de complexes polyribosomes. Si vous êtes recueillant des fractions d'ARN ou d'analyse des protéines, typiquement 0,2 min fractions sont prises (1 ml). Pour l'analyse de l'ARN, les fractions doivent être recueillis directement dans des tubes contenant Trizol (Invitrogen), le phénol ou SDS / protéinase K, selon la méthode préférée de l'extraction. Quand la fin du profil polyribosomes a été atteint, fermer le robinet de Fluorinert le tube de centrifugeuse et d'arrêter le mouvement graphique de l'absorbance / moniteur de fluorescence. Rentrez les Fluorinert du tube à centrifuger dans la seringue en commençant par le flux dans le sens inverse à une vitesse rapide en veillant à ne pas tirer de saccharose dans le tube dans la seringue. Dévissez le tube de centrifugation de l'pierceur tube, abaisser l'aiguille, et retirer le tube. Répétez les étapes 5.5 à 5.8 pour chaque gradient de saccharose. Lorsque tous les gradients de sucrose ont été analysés, rétracter la Fluorinert du tuyau de retour dans la seringue. Retirez chaque partie de fractionnement (perceur de tubes et de cellules d'écoulement), y compris le tuyau de déchets situé en haut et bien rincer avec de l'eau. 6. Les résultats représentatifs Figure 1. Oligo-Représentant de l'extrait préparé à partir de ribosome BY4741 souche de levure (tapis une his3 Δ Δ 0 1 leu2 met15 Δ 0 ura3 Δ 0), en présence de cycloheximide. L'extrait a été fractionné en utilisant ribosomique un gradient de saccharose 7 47% et analysées en utilisant un appareil de la seringue de la pompe attachée à un détecteur UV. Peaks contenant polyribosomes et 80S, 60S et 40S des ribosomes sont indiqués.