1. De Thermo Scientific Solaris qPCR Assay Ontwerp Algorithm Het algoritme gebruikt in het ontwerp van de Solaris qPCR probe / primerparen past de Tm van elke component waardoor universele fietsen voorwaarden. Incorporatie van de MGB, of minor groove binding, eenheid in de sonde verhoogt de Tm en zorgt voor kortere probes worden ontworpen voor een grotere assay flexibiliteit en prestaties. Zoals hun naam al aangeeft, MGBs zijn een klasse van antibiotica die kunnen passen in de kleine groef van de DNA-helix. MGBs zijn gekoppeld aan de 3 of 5 einde van een DNA-probe. In oplossing, is de FAM verslaggever fluorescentie van de sonde gedoofd door Eclipse Dark Quencher. Wanneer de probe bindt aan een doelsequentie, de daaruit voortvloeiende wijziging in 3-D van de sonde s bouw zorgt voor een sterke fluorescerende signaal. Binding van het DNA-sonde naar doelsequentie wordt gestabiliseerd door de MGB, die het gebruik van zeer specifieke, kortere probes kunnen met behoud van de juiste smelttemperatuur voor PCR. Zo signaaldetectie treedt op tijdens de annealing fase van doelamplificatie. Gedurende de verlenging stap, de MGB probe distantieert en de fluorescentie is weer gedoofd. Omdat de sonde distantieert, is het niet van invloed op PCR-efficiëntie. Een ander kenmerk van het Solaris-algoritme is het gebruik van Superbases. Superbases zijn gemodificeerde basen die verhoogde binding mogelijkheden om de stabiliteit van AT obligaties te verbeteren en de GG self-vereniging in guanine rijke sequenties te elimineren. Bovendien hebben ze niet uitdoven aangrenzende fluoroforen bevestigd op het 5 eindpunt. Deze bases worden selectief geplaatst, volgens het algoritme, om de beschikbaarheid van doelsequenties uit te breiden. Dit maakt het mogelijk om sequenties, zoals de GC-rijke regio's, die anders zouden worden vermeden in het ontwerpen van primers en probes. Waar mogelijk, de Solaris-algoritme bevat exon kruispunt verspreid over de regio's in de doelgroep site. Dit verhoogt de specificiteit door het vermijden van de amplificatie van verontreiniging genomisch DNA. Belangrijk is dat het algoritme wordt ook een consensus-sequentie voor alle bekende splice varianten, zodanig dat alle vallen onder een sonde / primer in te stellen. Zo is, is slechts een test nodig is voor een bepaald gen van belang. Ten slotte is de Solaris qPCR Assay ontwerp algoritme maakt gebruik van zeer strenge parameters voor het ontwerp kritische overwegingen, waaronder GC inhoud, lengte, Tm, en strekt zich uit van homogene nucleotiden. De resulterende sequenties worden BLAST geanalyseerd op specificiteit met behulp van 3 verschillende databases: genomische, transcript, en pseudogen. 2. Het verkrijgen van Solaris Reagentia Voor het verkrijgen van de juiste Solaris reagentia, bezoek www.thermo.com / solaris Klik eenmaal op de website van "GENEius Product Search". Om direct naar het GENEius product zoeken, ga dan naar www.thermo.com / SolarisSearch Klik in de zoekactie box en kies de gewenste doelorganisme. Het GENEius product zoeken kan verwerken veel verschillende gen-id's. Hier voert u een van de voorgestelde zoektermen om het gen van belang, met inbegrip Ref Seq toetreding, de Gene-ID, de Gene Symbol, een Gene Beschrijving, de Sanger-ID of toetreding nummer, of een catalogus nummer te vinden. Klik vervolgens op "Zoeken". Identificeer het gen van interesse en klik op "Select" op de linkerkant. Dit opent een venster waarin de verschillende Thermo Scientific producten die beschikbaar zijn voor het gen van interesse toont. Onder "Producten" selecteer dan de "qPCR Detection" Tab. Onder de "Solaris Gene Expression Assay" rubriek, ziet u een optimaal Solaris probe / primer test ontworpen. Deze test zal betrekking hebben op alle bekende splice-varianten van de genen doel. Kies de gewenste hoeveelheid. Ze zijn verkrijgbaar in 100, 200, 400, en 1000 X 25 ul reacties (als de test wordt geïdentificeerd als made-to-order, de 100 verpakkingsgrootte niet beschikbaar). Klik op "Add to Cart". Vervolgens selecteert u de juiste master mix voor de thermische cycler die zullen worden gebruikt. Om te bepalen welke master mix het beste zal werken met de machine beschikbaar, klik op "Zoek uit welke Master Mix werkt het beste met uw PCR Cycler!" Zoek de qPCR cycler die zal worden gebruikt op het menu om te bepalen welke mix te gebruiken. Keer terug naar het product GENEius zoekvenster, en selecteer de juiste master mix. De master mix wordt geleverd in 100, 200, 400, en 1000 reacties maten. Klik op "Add to Cart". Suggesties voor referentie genen en verso cDNA synthese kits kunnen ook besteld worden voor een complete qRT-PCR-analyse. Wanneer de Solaris qPCR reagentia aankomen, bewaar ze bij -20 ° C tot klaar voor gebruik. De volgende reagentia moeten worden ontvangen: een 20x-oplossing met twee primers die op 800 nM elk en een gen-specifieke probe die bij 200 nm, sequlingen informatie voor zowel de sonde en de primers en Solaris qPCR Gene Expression Master Mix in een 2X concentratie. Solaris qPCR Gene Expression Assays stabiel zijn voor een minimum van 12 maanden. Vermijd herhaaldelijk bevriezen ontdooien. 3. qPCR setup Begin de qPCR protocol met cDNA. Totaal RNA moet worden gewonnen met behulp van een spin kolom methode. De Thermo Scientific Verso cDNA synthese kit wordt aanbevolen voor reverse transcriptie tot cDNA te genereren. Bereid je voor op qPCR door het ontdooien van de primers, probes, en master mix op ijs. Ook bij de hand hebt PCR kwaliteit water en ondoorzichtig wit qPCR platen, die de gevoeligheid van de real-time PCR kunnen verbeteren. De master mix bevat alle componenten voor real-time PCR, waaronder: 1) Thermo-Start DNA-polymerase, een hot-start versie van Thermoprime DNA-polymerase. Dit type van polymerase wordt gebruikt om niet-specifieke amplificatie te voorkomen dat tijdens de reactie set-up en vereist activering stap bij 95 ° C 15 minuten. 2) dNTPs in het Solaris Master mix, dTTP vervangt dUTP om amplificatie-efficiëntie 3) Proprietary reactiebuffer, geoptimaliseerd om te werken met Solaris primer / probe assays te maximaliseren. Deze reactie buffer bevat blauwe kleurstof te verhogen contrast tussen reagens en kunststof. 4) ROX, als uw qPCR instrument vereist ROX. Zodra de oplossingen hebben ontdooid, meng door flicking de buis (niet vortex). Spin ze naar beneden om het verlies van reagens te voorkomen. Vervolgens bereiden een 15 ml steriel Falcon buis naar het opzetten van de reactie mix voor het gen van interesse, plus een voor de referentie-gen, opschalen afhankelijk van het aantal monsters. Bereid genoeg zodanig dat drie duplo kan worden voorbereid voor elk monster, met inbegrip van een template geen controle (NTC) en standaard curve monsters, indien de standaard curve methode zal worden gebruikt voor analyse. Voor elk monster te draaien op een 96 wells plaat, meng het volgende: 5 pi van de 2X Solaris qPCR Master Mix, 0,5 pi van de Solaris primer / probe set (20X), en PCR-kwaliteit water zodanig dat de uiteindelijke reactie volume, een keer het cDNA wordt toegevoegd wordt 25 uL worden. Voor elk monster te draaien op een 384 wells plaat mix van de volgende: 12,5 pi van de 2X Solaris qPCR Master Mix, 1,25 ul van de Solaris primer / probe set (20X), en PCR-kwaliteit water zodanig dat de uiteindelijke reactie volume, zodra de cDNA wordt toegevoegd zal 10 pi worden. Met behulp van een multi-channel pipet, overdracht van de master mix om de juiste putjes van de plaat. De blauwe kleurstof die in de master mix zal hulp bij het opsporen pipetteren de voortgang op de witte borden. Voeg vervolgens de 1-5 pi cDNA template (voor een 96 wells-plaat) of 1-2 ul van cDNA template (voor een 384 wells plaat). Pipet op en neer om te mengen. Plaats de plaat in een centrifuge en spin down om eventuele luchtbellen te verwijderen, omdat deze interfereren met de fluorescentie metingen. Programmeer de thermal cycler: Het enzym moet worden geactiveerd met een 95 ° C 15 min (een cyclus). Dan 40 cycli van 95 ° C, denaturatie gedurende 15 seconden, en gloeien en extensie bij 60 ° C gedurende 60 seconden. Plaats de plaat in de qPCR instrument. Start het programma. Representatieve qPCR resultaten met Solaris Figuur 1. Solaris testen geven een betrouwbare detectie, zelfs bij zeer lage concentraties ingang, zoals beoordeeld door de PCR-efficiëntie en r2 waarden. Tien 10-voudige verdunningen van cDNA gesynthetiseerd uit synthetische RNA-sequentie of amplicon DNA-sequentie werd geamplificeerd amplicon op een ABI 7900HT instrument met behulp van Solaris qPCR Gene Expression Assay voor F2RL1 of CDC20, respectievelijk. Het log-schaal versterking curves en standaard curves worden getoond, samen met de prestaties van elke analyse inclusief energie-efficiëntie, r2 waarde, dynamisch bereik van de 10 log10 verdunningen, en de ondergrens van detectie. Figuur 2. Solaris Testen geven consistente resultaten zelfs tussen verschillende onderzoekers en laboratoria. siRNA's gericht op ALDOA en PPIB, evenals een niet-targeting Control (NTC), werden getransfecteerd in HeLa cellen op 100, 10, 1 en 0,1 nM eindconcentraties. Cellen werden geoogst en totaal RNA geïsoleerd 48 uur na de behandeling. cDNA werd gesynthetiseerd met behulp van Thermo Scientific Verso cDNA synthese kit. Een hoeveelheid van het cDNA werd geamplificeerd in twee geografisch gescheiden laboratoria met behulp van Solaris qPCR Gene Expression Testen voor het opsporen van ALDOA, PPIB, en GAPDH op een Roche LightCycler 480 (384-wells) platform. Knockdown was berekend met de ΔΔCq methode (genormaliseerd voor GAPDH referentie-gen en NTC-behandelde cellen). Dezelfde niveaus van knockdown werden aangetoond voor zowel de gen-targets tussen beide onderzoekers van beide locaties.
