Toxine Inductie en eiwitextractie uit Fusarium Spp. Cultures for Proteoom Studies
Summary
Eiwitextractie voor proteomische analyses in schimmelsoorten vereist een hoge mate van standaardisatie te worden bereikt op basis van de minimale informatie over een proteomics experiment (MIAPE) richtlijnen. We presenteren een video-protocol, dat een procedure voor het minimaliseren van experimentele vooringenomenheid tijdens toxine inductie en eiwit-extractie uit omvat<em> Fusarium spp.</em
Abstract
Fusaria zijn filamenteuze schimmels in staat om verschillende gifstoffen produceren. Fusarium mycotoxinen, zoals deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric zuur, moniliformin, enz. .. negatieve effecten hebben op zowel mens en dier en sommige worden beschouwd als pathogeniteit factoren. Proteomische studies toonden effectief te zijn voor het ontcijferen van toxine productie mechanismen (Taylor et al., 2008). Alsook voor het identificeren van potentiële pathogene factoren (papier et al.., 2007, Houterman et al., 2007). Fusaria in. Het wordt daarom van fundamenteel belang betrouwbare methoden vast te stellen voor het vergelijken tussen de proteomische studies om te vertrouwen op echte verschillen gevonden in eiwitexpressie tussen de experimenten, stammen en laboratoria. De procedure die zal worden beschreven zou moeten bijdragen tot een grotere mate van standaardisatie van proteomics procedures door twee manieren. De gefilmde protocol wordt gebruikt om het niveau van de details die nauwkeurig kan worden beschreven toenemen. Bovendien is de beschikbaarheid van gestandaardiseerde procedures te verwerken biologische repliceert moet een hogere robuustheid van de gegevens te waarborgen, rekening houdend met de menselijke factor binnen de technische reproduceerbaarheid van de extractie-procedure.
De beschreven protocol vereist 16 dagen voor de voltooiing ervan: veertien dagen voor culturen en twee dagen voor eiwitextractie (figuur 1).
Kortom, zijn Fusarium stammen gekweekt op vaste media voor 4 dagen, ze zijn vervolgens handmatig gefragmenteerd en overgebracht naar een aangepaste toxine inducerende media (Jiao et al., 2008.) Gedurende 10 dagen. Mycelium wordt verzameld door filtratie door een Miracloth laag. Slijpen is uitgevoerd in een koude kamer. Verschillende operatoren uitgevoerd extractie repliceert (n = 3), om rekening te houden met de vertekening als gevolg van technische variaties (figuur 2). Extractie was gebaseerd op een SDS / DTT buffer zoals beschreven in Taylor et al.. (2008) met kleine wijzigingen. Totaal eiwitextractie vereist een neerslag proces van de eiwitten met behulp van aceton / TCA / DTT buffer 's nachts en Aceton / DTT wassen (figuur 3a, 3b). Eiwitten werden uiteindelijk resolubilized in het eiwit-etikettering buffer en gekwantificeerd. De resultaten van de extractie werden gevisualiseerd op een 1D gel (figuur 4, SDS-PAGE), alvorens over te gaan tot 2D-gels (IEF / SDS-PAGE). Dezelfde procedure kan worden toegepast voor proteomics analyses op andere groeiende media en andere filamenteuze schimmels (Miles et al., 2007)..
Protocol
Discussion
De recente interesse in proteomische benaderingen binnen de schimmel biologie domeinnaam heeft geleid tot een toename van het aantal publicaties met behulp van deze techniek (zoals besproken in Kim et al., 2007).. Methoden voor eiwitextractie rekenen op een combinatie van extractie procedures, ze zijn vaak nauwelijks beschreven in de methodologische secties en vereisen expertise in het omgaan met de mogelijke methoden voor probleemoplossing.
Net als voor andere "omics"-benaderingen, het vaststellen van normen voor het monster en verwerking van gegevens is essentieel om betrouwbare wetenschappelijke informatie te genereren. Bovendien monsters en procedures van manipulatie moeten adequaat worden omschreven, teneinde een gemeenschappelijk resultaat interpretatie tussen de verschillende "omics" experimenten toe te staan. Dit zou essentieel zijn voor het volledig benutten van potentieel van cross-data mining in genomics, proteomics, metabolomics, … (Morrison et al., 2006).. Minimale informatie over een proteomics experiment is opgesteld en de werkgroepen zijn ingesteld om alle aspecten van een experiment (gel electroforese, massaspectrometrie, moleculaire interacties, eiwitmodificaties, Proteomics Informatica, Sample Processing) aan te pakken. Op dit moment geen gebruik van informatie zijn beschikbaar op monster verwerking procedures. Gezien het belang van eiwit-extractie procedures in het bepalen van de uiteindelijke kwaliteit van proteoomanalyse studies, om procedures die standaardisatie kan verhogen in het kader van MIAPE richtlijnen (Taylor et al., 2007). Implementeren, hebben we voorgesteld het gebruik van een video-protocol waarin monster verwerking. Video beschrijving van de experimenten kunnen aanzienlijk bijdragen tot het aantal van informatie over de verwerking van monsters die kunnen leiden tot een betere reproduceerbaarheid van "omics" experimenten (Pasquali, 2007) te verhogen.
Inderdaad, reproduceerbaarheid over laboratoria is een fundamentele vereiste om de validiteit te waarborgen van proteomics resultaten (http://www.fixingproteomics.org). De cross-laboratorium reproduceerbaarheid wordt beïnvloed door twee factoren: verschillende bezettingen en verschillende operators manipuleren van monsters.
In de beschreven protocol, stellen we voor om te presteren biologische repliceert met meerdere operatoren (figuur 2 en video) naar de betrouwbaarheid van de gegevens (dat wil zeggen technische variant van de resultaten wordt rekening gehouden) te verhogen.
De procedure beschreven voor eiwit-extractie is gebaseerd op de SDS en verwarming. Dit werd eerder aangetoond dat een goede zuiverheid en hoeveelheid van eiwitten (Bridge 1996) te garanderen. SDS in combinatie met kokend lost celwanden, hydrofobe eiwitten en voorkomt de vorming van oligomeren die afbreken neerslag van eiwitten. Koken maakt het ook mogelijk inactivatie van proteasen. Hetzelfde effect wordt ook geproduceerd door EDTA, PMSF en complete mini-protease-remmer. DTT verwijdert disulfide bruggen in en tussen eiwitten faciliteren eiwit oplosbaar.
Om de SDS te verwijderen voordat IEF, zijn eiwitten neergeslagen door aceton / TCA / DTT. Bovendien, aceton / TCA / DTT neerslag kan het verwijderen van bepaalde verontreinigingen, zoals lipiden, nucleïnezuren, zouten en / of fenolische verbindingen wanneer deze verbindingen aanwezig zijn. Net als SDS, deze moleculen voorkomen dat een goede migratie tijdens het IEF. Na deze neerslag, is het noodzakelijk om de neergeslagen eiwitten wassen aceton / DTT, om TCA te verwijderen als het kan interfereren met IEF.
Een goed voorbeeld voorbereiding is de sleutel tot goede resultaten. Voor deze, is het ook essentieel om te voorkomen dat verontreiniging van eiwitten uit de omgeving het werken met poeder handschoenen en het respecteren van goede laboratoriumpraktijken. Vanuit een technisch oogpunt, binnen het beschreven protocol, de meest kritische stappen voor het verkrijgen van voldoende hoeveelheden en de zuiverheid van eiwitten zijn twee fasen. Eerste, het slijpen fase waarin volledige vernietiging van de cel is fundamenteel voor eiwitten vrijkomen, en ten tweede, de zuivering van totale eiwitten, een fase omvat het verwijderen van de meerderheid van de lipiden, DNA en andere verontreinigingen die kunnen interfereren met de migratie van eiwitten.
Acknowledgements
Wij danken Servane Contal en Boris Untereiner voor hun technische bijdrage. Wij erkennen de steun van FNR "FUTOX" project.
Materials
Media and solutions
PDA: 39 g Potato Dextrose Agar (Difco); 1 L distilled water.
V8 agar: 200 ml V8 (campbell’s, USA), 2g CaCO3 (Sigma), 16g Agar (DIFCO), 800 ml distilled water
Toxin inducing media: 1g K2HPO4, 0.5g KCl, 0.5g MgSO4 7H2O, 10 mg FeEDTA, 2g L glutamic acid, 10g sucrose in 1L of distilled water.
Lysis Buffer:
| 100mL | Final concentration | ||
| Tris-HCL pH8 | 5mL | 50mM | 1M |
| SDS | 2g or 10mL | 2% | 20% |
| DTT | 500mL | 10mM | 2M |
| EDTA | 20mL | 0.1mM | 0.5M |
| PMSF | 200mL | ||
| Complete mini protease inhibitor | 1 tablet | ||
| Water | Qsp |
Precipitation Buffer:
| 100mL | Final concentration | |
| TCA | 20mL | 20% |
| DTT | 0.1mL | 0.1% |
| Aceton | Qsp |
Washing Buffer:
| 100mL | Final concentration | |
| DTT | 0.1mL | 0.1% |
| Aceton | 100mL |
Labelling Buffer (store at -18°C in small aliquots):
| 1mL | Final concentration | |
| Urea | 140 mg | 7M |
| Thiourea | 50 mg | 2M |
| CHAPS | 40 mg | 4% |
| Tris | 30 µL | 30 mM |
| Water | 1 mL |
References
- Bridge, P. Protein Extraction from Fungi. Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).
- Jiao, F. Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture. FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).
- Kim, Y. Proteomics of filamentous fungi. Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).
- Milles, J. Development of a proteomic approach to monitor protein synthesis in mycotoxin producing moulds. Mycotoxin Res. 23, 161-165 (2007).
- Morrison, N., Field, D. Concept of sample in OMICS technology. OMICS. 10, 127-137 (2006).
- O’Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. PNAS. 95, 2044-2049 (1998).
- Paper, J. M. Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum. Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).
- Pasquali, M. Video in science. Protocol videos: the implications for research and society. EMBO Rep. 8, 712-716 (2007).
- Taylor, C. F. The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE). Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).
- Taylor, R. D. Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions. Proteomics. 8, 2256-2265 (2008).
