双体录音从促性腺激素释放激素（GnRH）神经元下丘脑薄片鉴定绿色荧光蛋白（GFP）

下丘脑脑片准备，培养和转移以前详细的录音室（9）在动物的GnRH神经元表达GnRH的肽子（10）控制下的绿色荧光蛋白（GFP）。从动物的大脑取出后，大脑是用刀片，以消除不感兴趣的地区封锁。为了确定删除的地区，大脑是放置在其背水面，使下丘脑可以可视化。对于这两种冠状​​面和矢状面片的方向，小脑被删除。冠状切片准备，皮层延髓部分将被删除。在这片取向，皮层外侧地区提供支持大脑切片和银线的位置，以确保在录音室的大脑，大脑提供足够的面积。矢状切片准备，大脑外侧地区和皮质延髓部分提供的脑切片和银线的位置，以确保在录音的大脑以及支持。整个阻断过程中，大脑是不断蘸冷人工脑脊液中使用的玻璃吸管（学联）。 少量的强力胶放在切割平台上。大脑是用抹刀解除。超额学联带来一个Kimwipe锅铲表面和绘图过剩学联从大脑中删除。大脑是轻轻滑落到胶水。触摸大脑或推下来，以确保它是很重要的。大脑本身的重量通常是足够的，以确保它是安全的。 大脑和切割平台上，然后固定在振动切片机和切割以及充满冷学联。寒冷的解决方案两家公司的大脑，并可能在切割过程中不受损坏保护。在寒冷的程度，优化质量片不同的大脑区域不同。编制下丘脑薄片学联温度一般在0 ° C 应缓慢切割片，每个切片从大脑，应该自由浮动。如果片开始卷曲在切割过程中，刀片正在推进的速度应放慢。我们可以使用一个将其展平片的小油漆刷，但这样做风险损害的切片，因此，应尽量避免。慢慢刀片的前进速度优于使用油漆刷。 由于每个切片切断从大脑，它是从切割室撤回，并放置在一个温水浴（约32 ° C）的片孵化室。切片孵化器不断提供与使用的95％O 2和5％的CO 2的氧气的混合物。一般情况下，预录片潜伏期从30分钟到2小时不等。 玻璃吸管（3-6MΩ）制造如前所述（9）使用垂直拉拔。拉动的持续时间和温度变化的基础上的吸管拉马使用，玻璃使用的加热丝的拉拔寿命。枪头的形状可以根据用户的喜好也各不相同。一个0.1毫米的开放统一的锥形尖，我们已经取得了良好的成功。在吸管的开口更大，往往会损害神经元，而较小的开口失败导致持续时间长的录音。 涂与Sylgard移液器，以减少电容。拉枪头轻轻涂抹Sylgard 184使用第二个吸管。 Sylgarded提示，然后用热风枪加热固化。这些移液器充满浴灌流。为了增加可视化的枪头，加入少量的Alexa – 568液用于灌装前的移液器移液器解决方案的一部分。我们不重量的Alexa – 568而是使用足以让眼睛的解决方案，粉红。枪头，然后可以根据得克萨斯州红色滤光片显示。 我们已经开发出一种方法来获得电流钳检测使用低阻力密封件（见讨论）的行动潜力。内源性细胞的静息电位没有适用于目前使用的Axon仪器的2B Axoclamp录音。但是，由于低电阻密封，不能只用2B放大器检测动作电位。为了提高信号，第二个放大器（AM系统3000）是用于与Axoclamp 2B系列。这种方法有松动的密封和长期的唱片实用方便。从技术上讲，可以直接测量动作电位，从而规避在电压钳记录模式与方法的问题（见讨论）。 一个需要两个移液器以前选定的两个神经元的表面在同一时间，在类​​似的方式作为对全细胞记录配置的方法。走近两个NE同时urons已比较成功的，在获得独立不是试图对每一个神经元的双唱片。在这段时间内，注入电流脉冲通过从2B放大器在全细胞记录的方法进行。 都移液器必须保持正压，以防止堵塞尖。最好使用悬空3毫升空注射器连接管件的长度吸管​​持有人产生正压双录音。使用注射器，允许上都移液器保持压力。正压应尽快移液器一直在录音室的液放在应用。一种方法移液器顺序选定的神经元。定位后最大的神经元表面的第一个吸管直接，保持积极的留在注射器和叶子在这个位置上的吸管。然后返回到录音室的顶部和降低位置的第二个记录吸管。选择神经元往往是在不同层次的切片。第一移液器应定位在神经细胞最深的是在切片和更肤浅的神经元位置的第二个吸管。这可以防止转向第二吸管定位片将在垂直平面内移动略有移液器进入片的第二个吸管定位。 松散密封（18-30MΩ）将被使用。正压力将促使每个细胞的表面上的一个小酒窝。人们试图释放正压和应用非常轻微的负压密封的第一个神经元。正压释放取出注射器。经口吸气，然后将其应用于油管的自由端。一个健康的神经元的膜将迅速做出反应释放的正压和坚持移液器。轻微的吸力将形成一个密封在一个健康的神经元的适当性。 尝试当一个密封的神经元和失败，吸液管不能被重新使用，因为膜只密封非常干净的玻璃。相反，提高移液器（物镜）离片表面的灌注井的顶部，从浴缸中删除的吸管，干净的移液管的变化，然后返回到切片试图密封另一个单元格。基于这些原因，重要的是要选择多个录音潜在的神经元。对于片不少于4-6录音质量的神经细胞，从中选择，获得双录音的成功是有限的。 建立一个松散的密封电阻后，从2B放大器的电流注入脉冲终止​​。 2B amplifer是摆在系列与3000系列amplifer。在此配置中，2B amplifer的输出作为输入为3000系列amplifer。后者amplifer提供数据采集的信号。 然后重复密封（步骤4）amplifers的重新配置（步骤5）的第二个神经元。 图1。一个时期，增加射击两个GnRH神经元在矢状切片准备宽松的密封连接的记录配置。片是来自一个阉割的男性。每向上偏转表示动作电位。注意GnRH的神经元（顶部的痕迹）展品几乎连续发射，而第二GnRH的神经元具有间歇性的阵阵。这种模式从单一的GnRH神经元的活动期间（7）体内的激素分泌多单元录音中提取的单一单位。请点击这里看到图1的放大版本。