Isolatie van Mouse buikholte Cellen
Summary
De peritoneale holte in zoogdieren bevat verschillende immuun cel populaties cruciaal voor de aangeboren immuunrespons. Een efficiënte isolatie methode is vereist voor biochemische en functionele analyse van deze cellen. Hier bieden wij een uitgebreide methode voor de isolatie van de peritoneale holte cellen in de muis.
Abstract
De peritoneale holte is een membraan-gebonden en met vloeistof gevulde buikholte van zoogdieren, die de lever, de milt, het grootste deel van het maag-darmkanaal en andere ingewanden bevat. Het herbergt een aantal van de immuuncellen waaronder macrofagen, B-cellen en T-cellen. De aanwezigheid van een groot aantal naïeve macrofagen in de buikholte is het een te verkiezen plaats voor het verzamelen van naïeve weefsel inwoner macrofagen (1). De peritoneale holte is ook belangrijk voor de studie van B-cellen als gevolg van de aanwezigheid van een unieke buikholte-ingezeten B-cel subset bekend als B1 cellen in aanvulling op de conventionele B2 cellen. B1-cellen worden onderverdeeld in B1a en B1b cellen, die kunnen worden onderscheiden door de oppervlakte-expressie van CD11b en CD5. B1-cellen zijn een belangrijke bron van natuurlijke IgM vroegtijdig bescherming tegen een groot aantal pathogenen (2-4). Deze cellen zijn autoreactieve in de natuur (5), maar hoe ze worden gecontroleerd tot autoimmuniteit te voorkomen, is nog niet geheel duidelijk. Integendeel, CD5<sup> +</sup> B1a cellen beschikken over een aantal regulerende eigenschappen op grond van hun IL-10 producerende capaciteit (6). Daarom buikholte B1-cellen zijn een interessant celpopulatie om te studeren vanwege hun verschillende functie en vele ongeadresseerde vragen in verband met hun ontwikkeling en regelgeving. De isolatie van peritoneale holte inwoner immuuncellen is lastig vanwege het ontbreken van een gedefinieerde structuur in de buikholte. Ons protocol beschrijft een procedure voor het verkrijgen van levensvatbare immuuncellen uit de buikholte van muizen, die vervolgens kan voor fenotypische analyse worden gebruikt door flowcytometrie en voor verschillende biochemische en immunologische assays.
Protocol
Discussion
Isolatie van peritoneale holte cellen is een belangrijke techniek voor de studie van verschillende immuuncellen, voornamelijk macrofagen en specifieke B-cel subsets. Hoewel dit een eenvoudig proces, zijn er een aantal betrokken kritische stappen. Aanwezigheid van contaminerende bloed in de verzamelde monster moet worden vermeden om een pure buikholte celpopulatie te verkrijgen. Euthanasie door cervicale dislocatie moet zorgvuldig worden gedaan om besmet bloed in de buikholte te vermijden. Als alternatief CO 2 kan worden gebruikt. Daarnaast moet tijdens de procedure goede zorg worden genomen om te voorkomen dat aanprikken van de blaas of enige andere organen in de buikholte. Herstellen de meeste van de geïnjecteerde vloeistof is ook belangrijk om de cel te geven.
Deze procedure wordt op grote schaal gebruikt om de macrofagen biologie, omdat matige aantallen inwoner studie, kunnen niet-gestimuleerde macrofagen gemakkelijk verkregen worden uit de buikholte, in tegenstelling tot de moeizame taak van het onderscheid myeloïde voorlopercellen cellen in volwassen macrofagen in vitro, met behulp van macrofaag kolonie stimulerende factor (8 , 9). De macrofaag opbrengst van de buikholte kan worden verbeterd door gebruik te maken van de thioglycollate elicitatie methode, hoewel thioglycollate gebruik kunnen veranderen fysiologische eigenschappen van de macrofagen (7).
B-cellen zijn een belangrijk onderdeel van ons immuunsysteem speelt cruciale rol in zowel de aangeboren en adaptieve immuniteit. Tussen de verschillende B-cel subpopulaties, B1 cellen bestaan uit een unieke deelgroep van B-cellen die betrokken zijn bij aangeboren immuniteit, auto-immuniteit en immuunregulatie. B1 cellen zijn voornamelijk gelegen in de buikholte en zijn zelf aanvullen. Ze zijn een van de primaire producenten van natuurlijke IgM waarvan de eerste regel van de bescherming tegen een aantal virussen en bacteriën (10-12) biedt. B1-cellen zijn ook een belangrijke bron van IL-10 (6), dat is een belangrijk cytokine die betrokken zijn bij immuun regelgeving. Hoewel verschillende studies zijn gevoerd met de B1 cellen, er nog steeds ruimte is voor verdere evaluatie van hun contrasterende functies, in het bijzonder hun regulerende rol. Buikholte celisolatie methode biedt de unieke mogelijkheid om de functies van de B1 cellen te bestuderen.
Acknowledgements
Dit werk werd mede ondersteund door de NIH subsidie AI069358 en de BloodCenter Research Foundation.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Thioglycollate Medium, Brewer Modified | BD BBL | 211716 |
References
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2008).
- Boes, M., Prodeus, A. P., Schmidt, T., Carroll, M. C., Chen, J. A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection. J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).
- Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia. J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).
- Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L. D., Rajan, T. V. B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites. J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).
- Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes. J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).
- O’Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10. Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).
- Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O. C., Jager, G. C., Herzenberg, L. A. The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).
- Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection. J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).
- Berland, R., Wortis, H. H. Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5. Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).
