Esgotamento das populações de células específicas de Esgotamento Complemento
Summary
Para efetivamente estudar a função de populações de células imunes sua purificação é muitas vezes necessária. Esgotamento complemento é uma técnica rápida e barata para o isolamento de populações de células imunes, com alta pureza.
Abstract
A purificação de populações de células imunes é muitas vezes necessária a fim de estudar as suas funções originais. Em particular, as abordagens moleculares, como PCR em tempo real e análise de microarrays requer o isolamento de populações de células com elevado grau de pureza. Estratégias de purificação comumente usados incluem separação de células fluorescentes ativado (FACS), a separação grânulo magnético e esgotamento complemento. Das três estratégias, esgotamento complemento oferece as vantagens de ser rápido, barato, gentil nas células e um rendimento de células de altura. O sistema complemento é composto por um grande número de proteínas plasmáticas que quando ativados iniciam uma cascata proteolítica culminando com a formação de um complexo de ataque à membrana, que forma um poro em uma superfície da célula, resultando em morte celular<sup> 1</sup>. A via clássica é ativada por anticorpos IgM e IgG e foi descrita pela primeira vez como um mecanismo para matar bactérias. Com a geração de anticorpos monoclonais (mAb), a cascata do complemento pode ser usada para lisar qualquer população de células de uma maneira antígeno-específicas. Depleção de células, a cascata do complemento é obtido pela adição de complemento de fixação antígeno-anticorpos específicos e complemento de coelho para a população de células de partida. As células são incubadas por uma hora a 37 ° C e as células lisadas são posteriormente removidas por duas rodadas de lavar roupa. O mAb com uma alta eficiência de fixação de complemento geralmente destroem 95-100% da população de células-alvo. Dependendo da estratégia de purificação para a população de células alvo, esgotamento complemento pode ser utilizada para a purificação de células ou para o enriquecimento de populações de células que, então, pode ainda ser purificada por um método subseqüentes.
Protocol
Discussion
A purificação de populações de células é um procedimento comum necessário para o estudo das suas funções. Aqui nós descrevemos um método rápido e eficaz de esgotar populações de células com antígeno de anticorpos específicos e esgotamento complemento. O esgotamento de qualquer população de células pode ser alcançado se um anticorpo ativadores de complemento está disponível para um marcador de linhagem específica. Aqui demonstramos a depleção de células T usando um mAb específicas para Thy1, uma proteína expressa essencialmente por todas as populações de células T. Nós esgotado mais de 95% das células T αβ e os restantes esplenócitos foram aumentados de 68% para 98%. Este nível de pureza das células é semelhante a outras estratégias de purificação e separação incluindo FACS grânulo magnético. Esgotamento complemento é uma técnica rápida que pode ser realizado em 1,5 horas, uma vez a população de células de partida é obtida. Outra vantagem do esgotamento complemento é que qualquer laboratório pode realizar a técnica, pois não requer equipamento caro e reagentes. As únicas peças principais do equipamento necessário é um banho de água e uma centrífuga. Complemento de coelho pode ser comprado de uma variedade de fornecedores a um custo razoável (ver tabela de reagentes) e mAb muitos pode ser comprado de ATTC e cultivado localmente para controlar custos. Em contraste, FACS requer um citômetro de fluxo com capacidade de separação de células que vai custar nos seis números e caro mAb fluorescente etiquetado. Separação grânulo magnético está com preços moderados, mas requer a compra de um ímã e esferas magnéticas, que podem ser caros. Além disso, algumas estratégias de separação magnética talão também exigem a compra de colunas.
O principal obstáculo para o uso de complemento para depleção de células é a disponibilidade de complemento ativando mAb com a especificidade de antígeno necessária. Embora os anticorpos do rato humano, e todos os ratos têm a capacidade de fixar o complemento, alguns isotipos são melhores que outros. Apesar de IgM de todas as três espécies é altamente eficaz na fixação complementar o isotipos IgG variar. Assim, cada mAb deve primeiro ser testada em um estudo piloto para determinar a sua eficácia. Para anticorpos que não são altamente eficientes, duas rodadas de esgotamento complementar pode ser realizada sem afetar a viabilidade das populações de células remanescentes. Como uma economia de custos, os anticorpos devem ser ajustadas para uma eficácia óptima. Além disso, os anticorpos utilizados não precisa ser purificado. Sobrenadantes hibridoma e ascite trabalho fluido tão eficazmente, que é particularmente conveniente para anticorpos IgM, que são difíceis de purificar. Tal como acontece com os anticorpos, é imperativo que o complemento ser titulada em um estudo piloto. Um muito alto de concentração resultará na perda da viabilidade das populações não-alvo celular. Também importante é que o tempo de incubação não exceda 60 minutos.
Em nosso protocolo, que co-incubação do anticorpo e do complemento juntos. No entanto, as células podem ser rotulados com anticorpos para 15-30 minutos e lavado antes da adição do complemento. Ao usar esta estratégia, certifique-se de realizar a incubação de anticorpos no gelo para evitar a perda do antígeno de células na superfície da célula, como ocorre com algumas proteínas por patching e nivelamento ou internalização do receptor. Apesar de altamente eficiente, a principal desvantagem para complementar o esgotamento, em comparação com outros métodos é que ele não pode ser usado para a seleção positiva. Assim, é difícil obter subpopulações de células. Por exemplo, seria difícil para purificar as células B de zona marginal de células B folicular, o que seria melhor ser feito por FACS. Nesta situação, a ativação do complemento pode ser usado para retirada de células T para reduzir o número de células que estão sendo classificados. Esta estratégia seria reduzir o tempo de classificação, o que economizar dinheiro e seria menos severo nas células.
Desde a purificação de populações de células específicas é um requisito comum uma série de estratégias têm sido desenvolvidas. As principais vantagens da estratégia de esgotamento complemento estão a sua acessibilidade, simplicidade técnica e economia de tempo.
Acknowledgements
Gostaria de agradecer Sreemanti Basu pelo fornecimento dos dados para a Figura 1. Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH conceder AI069358 ea Fundação de Pesquisas BloodCenter.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-4 week baby rabbit complement | Pel-Freez Biologicals | 31061-3 | ||
| Water bath | various | various | An incubator set at 37 °C can also be used. |
References
- Janeway, C., Travers, P. The Immune System in Health and Disease. Immunobiology. , (1994).
- Jones, B. Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation. Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).
