הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts עכבר עובריים עם פקטור ארבעה תמלול, דוקסיציקלין ועין מתנהלת מערכת התמרה lentiviral

<p class="jove_title"> 1. התמרה ויראלי של MEFs</p><ol><li> יום לפני תחילת הניסוי, מעיל תא 15 ס"מ תרבות צלחת עם סטרילי ג'לטין 0.2% מסוננת ב DDH₂ א ' דגירה את הצלחת לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO₂.</li><li> לשאוב את הנוזל מתוך צלחת מצופה ג'לטין ו MEF בתאי זרע (השתמשנו Nanog-GFP/rtTA תאים MEF) בצפיפות של 4×10⁵ תאים לכל מאכל. דגירה התאים 30 מ"ל של מדיום הגידול MEF (450ml DMEM בתוספת 50 מ"ל FBS, 5 מ"ל 100x שאינם חיוניים חומצות אמינו, 5 מ"ל פניצילין / סטרפטומיצין, 5 מ"ל 200 מ"מ L-גלוטמין ו – 0.5 מ"ל β-55mm mercaptoethanol) עבור יומיים ב 37 ° C ו-CO 5%₂ עד כ 80% ומחוברות.</li><li> לשאוב הבינוני להוסיף 30 מ"ל של מדיום הגידול MEF בתוספת lentivirus מרוכז (4 x 100 μl וירוס מניות פתרון + 29.6 צמיחה בינוני מ"ל). הסלע צלחת בעדינות כדי להבטיח אפילו הפצה של המדיום. דגירה התאים לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO₂.</li></ol><p class="jove_title"> 2. דוקסיציקלין מושרה תכנות מחדש</p><ol><li> 20-24 שעות שלאחר התמרה, trypsinize התאים transduced, צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות ו resuspend במדיום ES / iPS צמיחה (450 מ"ל נוק DMEM בתוספת 50 מ"ל תא מוסמך ES עגל בסרום, 5 מ"ל פניצילין / סטרפטומיצין, 5 מ"ל 200 מ"מ L-גלוטמין, 0.5 מ"ל ו – β-mercaptoethanol 25 LIF μl). זרעים transduced MEF של בריכוז מתאים את גודל המנה תרבית תאים (השתמשנו 2.5 x 10⁵ תאים לכל צלחת 10 ס"מ עבור reprogramming ניסויים יעילות הבידוד המושבה, ו 2 x 10⁴ לכל התאים היטב 4 צלחות היטב לניסויים ICC). דגירה לילה בשעה 37 ° C ו-CO 5%₂. הערה: כל התאים transduced הנותרים ניתן להקפיא בחנקן נוזלי לצורך ניתוח עתידי.</li><li> לשאוב את המדיום ולהחליף ES / iPS בינוני מוכן טריים בתוספת דוקסיציקלין לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​(גם הוספנו בינוני ללא DOX כביקורת שלילית). לדגור על 37 ° C ו-CO 5%₂.</li></ol><p class="jove_title"> 3. ניתוח Immunocytochemical של יעילות התמרה</p><p class="jove_content"> 48 שעות שלאחר דוקסיציקלין אינדוקציה, לקבוע יעילות התמרה על ידי אימונוהיסטוכימיה (ICC). ביצוע בדיקות ICC על תאים replated ב 4 צלחות היטב. כרכי כל הרשומים בפרוטוקול הבא צריך להיות מותאם על פי גודל תרבית תאים בצלחת.</p><ol><li> לשטוף את התאים בעדינות פעם עם PBS (ללא Mg^{2 +} + או Ca^{2 +}).</li><li> תקן את התאים μl 500 מ"ל של paraformaldehyde 0.5 4% PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li><li> לשטוף את התאים בעדינות פעמיים עם PBS.</li><li> Permeabilize תאים על ידי הוספת 500 μl של קר כקרח 0.2% Tween ® -20 ב PBS. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li><li> לשטוף את התאים בעדינות פעמיים עם PBS.</li><li> בלוק הלא ספציפית מחייב עם חיץ 200 μl חסימת שעה אחת בטמפרטורת החדר.</li><li> דגירה התאים עם 200 μl של הנוגדן העיקרי ספציפי לילה ב 4 ° C (השתמשנו Oct4, Klf4, Sox2 ו c-myc).</li><li> לשטוף את התאים בעדינות פעמיים עם PBS.</li><li> דגירה התאים עם 200 μl של נוגדנים משני שעה 1 בטמפרטורת החדר, להגן על צלחות מן האור (השתמשנו חמור נגד ארנב המצומד Rhodamine, עיזים וחמורים נגד AlexaFluor ® 594 המצומד, חמור נגד עכבר Rhodamine המצומד וחמור נגד הארנב-Rhodamine המצומד).</li><li> לשטוף את התאים בעדינות פעמיים עם PBS.</li><li> הוסף DAPI (הריכוז הסופי 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​PBS) וכן דגירה 10 דקות כדי להמחיש גרעינים.</li><li> לשטוף את התאים בעדינות עם PBS.</li><li> הוספת אנטי לדעוך אקווה הר לפני הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה.</li></ol><p class="jove_title"> 4. בידוד והרחבת iPS המושבות Cell</p><ol><li> לאחר שיזם את תהליך תכנות מחדש (כמתואר בסעיף 2), לפקח על תרבויות בינוני להחליף כל 48 שעות. השתמשנו בינוני דוקסיציקלין המכיל את התרבות התאים לשנים עשר הימים הראשונים ולאחר מכן הוסר בעקבות דוקסיציקלין מן המדיום על מנת להבטיח כי המושבות iPS ידני הרים להרחבת יהיה DOX עצמאית.</li><li> תאים צריכים להיות במעקב יומי שינויים מורפולוגיים המעידים על תהליך תכנות מחדש, או בעת השימוש בתאים כמו Nanog-GFP/rtTA MEF, מורפולוגיה לפקח הפלואורסנציה של GFP לזהות מושבות reprogrammed. כל ניסוי יהיה שונה, אבל הם בדרך כלל במושבות גדולות מספיק בידוד בין 16 ו – 22 ימים. מושבות זיהו במהלך פרק זמן זה אז יכול להיות מבודד ידנית trypsinized להתרחבות וניתוח.</li><li> יום לפני בידוד trypsinizing המושבות reprogrammed, להכין צלחת 24 גם על ידי זריעת עם גמא מוקרן מזין שכבת MEFs בצפיפות של 5 x 10⁴ לכל התאים היטב. דגירה לילה בשעה 37 ° C ו-CO 5%₂.</li><li> ידנית לבחור כל המושבה השב"ס trypsinize לנתק המצרפים התא. Re-הצלחת iPS תאים בינוניים ES / iPS בבארות בודדים של צלחת 24 היטב מראש seeded עם גמא מוקרן מזין שכבת MEFs. וולס צריך להיות זורעים בצפיפות של 2 x 10⁵ תאים / היטב. לדגור על 37 ° C ו-CO 5%₂. שינוי התקשורת כל 24 שעות.</li><li> Monitor מושבות iPS יומי לצמיחה הקרינה GFP. אנו דגירה התרבויות שלנו במשך 6 ימים לפני passaging.</li><li> קביעת בארות צלחת 24 גם הם באופן אחיד המבטא GFP. וולס כי יש ביטוי של GFP טוב יכול להיות trypsinized ו passaged 01:08 לתוך 4 צלחות היטב כי כבר מראש seeded עם גמא מוקרן מזין שכבת MEFs. הצלחות אלה יכולים לשמש לניתוח סמן pluripotent על ידי ICC ו מכתים AP.</li></ol><p class="jove_title"> 5. ניתוח Immunocytochemical עבור pluripotency</p><p class="jove_content"> בדיקות ICC שלנו בוצע על תאים התרחבה 4 צלחות היטב. כרכי כל הרשומים בפרוטוקול הבא צריך להיות מותאם על פי גודל תרבית תאים בצלחת.</p><ol><li> לשטוף את התאים בעדינות פעמיים עם PBS (ללא Mg^{2 +} + או Ca^{2 +}).</li><li> דגירה של 0.5 מ"ל של 0.2% קר כקרח Tween 20 ב PBS לכל היטב במשך 10 דקות.</li><li> לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS.</li><li> בלוק הלא ספציפית מחייב עם חיץ 200 μl חסימת שעה אחת בטמפרטורת החדר.</li><li> דגירה התאים עם 200 μl של הנוגדן העיקרי ספציפי לילה ב 4 ° C (השתמשנו SSEA-1, Nanog ו Oct4).</li><li> לשטוף את התאים בעדינות פעמיים עם PBS.</li><li> דגירה התאים עם 200 μl של נוגדנים משני שעה 1 בטמפרטורת החדר, שמירה מן האור (השתמשנו חמור נגד עכבר Rhodamine המצומד ואת חמור נגד ארנב המצומד Rhodamine).</li><li> לשטוף את התאים בעדינות פעמיים עם PBS.</li><li> הוסף DAPI (הריכוז הסופי 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​PBS) וכן דגירה 10 דקות כדי להמחיש גרעינים.</li><li> לשטוף את התאים בעדינות עם PBS</li><li> הוספת אנטי לדעוך אקווה הר לפני הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה.</li></ol><p class="jove_title"> 6. Alkaline phosphatase (AP) מכתים של מושבות iPS Cell</p><ol><li> IPS מושבות של סעיף 4 ניתן גם לנתח פעילות AP ניצול ערכות זמינים מסחרית ובעקבות פרוטוקול של היצרן.</li></ol><p class="jove_title"> חלק 7. נציג תוצאות</p><p class="jove_content"> עכבר Stemgent DOX ועין מתנהלת TF הגדר Lentivirus ניתן לתכנת מחדש תאים MEFs iPS. לאחר התמרה של MEFs, הביטוי של גורמי תעתוק Oct4, Sox2, Klf4 ו c-myc ניתן להבחין בתאים שטופלו דוקסיציקלין (DOX +), אבל הביטוי קטנה או לא ניתן לאתר (DOX-) בתאים שלא טופלו (איור 1) . שינויים מורפולוגיים יתקדמו לאורך זמן (12 ימים של טיפול DOX בדוגמה זו) כדי לייצר ES גדול יותר, יותר דמוי תא מושבות עם קצוות מוגדרים המושבה ושלושה צמיחה ממדי (תמונה 2 א). כאשר DOX מוסר, יש חזרה בולט של מורפולוגיה הסלולר עבור חלק דמוי תא מושבות ES, לעומת זאת, רבים מן המושבות שמרו מורפולוגיה iPS שלהם (איור 2 א). אלו מושבות iPS, כאשר הרים ו passaged, להציג סמן טיפוסי ביטוי pluripotency של phosphatase אלקליין (AP), Nanog, Oct4 ו SSEA-1 (איור 3). סוג של תאים MEF השתמשו בניסוי הזה (Nanog-GFP/rtTA תאים MEF) להביע GFP מן מוקד Nanog אנדוגני כאשר reprogrammed למדינה pluripotency. ביטוי של GFP ולכן יכול לשמש כאינדיקטור מקדים reprogramming מוצלח (איור 3).</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig1.jpg" alt="Figure 1" > איור 1:</strong> Immunocytochemistry (ICC) ניתוח 48 שעות שלאחר DOX אינדוקציה. הפאנל השמאלי (-DOX) הוא פקד שלילי נציג לביטוי של ארבעה גורמים התמרה ללא אינדוקציה DOX. גורמי שעתוק הביעו כראוי אושרו על ידי נוגדנים המתאימים (באדום), מוכתם DAPI לדמיין את הגרעין.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig2.jpg" alt="Figure 2" > איור 2:</strong> המרת מורפולוגי של Nanog-GFP/rtTA MEFs למדינה תא iPS. א) שלב 100x בניגוד הדמיה של תאים הוכחת דחיסה והמרה של MEFs לתוך מושבות iPS לאורך זמן מיום 3 (D3 + DOX) ליום 22 (D22). DOX בוטל ביום 12. הפאנל השמאלי העליון: 20x תמונה מלאה שליליות-DOX צלחת. ב) 200x שלב בניגוד ותמונות GFP הקרינה של יום הדגיש שלאחר 18 DOX iPS אינדוקציה המושבה. ג) 200x שלב בניגוד ותמונות GFP הקרינה של 18 יום נוספים לאחר DOX iPS אינדוקציה המושבה.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig3.jpg" alt="Figure 3" > איור 3:</strong> ניתוח של מושבות iPS. (א) בניגוד שלב מיקרוסקופיה מכתים AP המושבה iPS (200x). (ב) ניתוח סמן pluripotency: פאנל שמאלי מראה בניגוד שלב שכבת עם הביטוי העיתונאי GFP תכנות מחדש. ביטוי של GFP משקף את רמת ביטוי אנדוגני Nanog. פאנל התיכון מראה מכתים ICC עבור סמנים pluripotency. הפאנל הימני מראה DAPI מכתים לדמיין את הגרעינים (100x).</p>