Fare Retina Ganglion Hücreleri Gen İfadesi utero ve ex vivo Elektroporasyon

Bölüm 1: utero ve ex vivo retina electroporations için ayarlama 1. Utero ve ex vivo retina electroporations her ikisi için Ince uçlu mikropipetler hazırlamak ve açılı bir noktaya yapmak için ucu (veya konik ucu) kırmak için bir elektrot çektirmesi kullanın. Istenilen konsantrasyonlarda DNA çözümleri hazırlayın ve Hızlı Yeşil Boya (% 0.05) enjeksiyonları görselleştirmek için küçük bir miktar eklemek. Utero retina electroporations için annenin başına 5 ul DNA çözümü ve ex vivo retina electroporations için embriyonik başına 1 ul DNA çözüm öneriyoruz. Transfekte nöronlar görselleştirmek için bir GFP ifade oluşturmak (ya da diğer floresan protein) ekleyin. Cerrahi aletler otoklav yoluyla sterilize edin. 100 mcg / ml ketamin 1.0:0.2:4.6 hacimsel oranı: 100 mg / ml ksilizin: tuzlu aşağıdaki oranı (her hamile kadın için yaklaşık 0,2 ml) ile ketamin ksilizin anestezik karışımı hazırlayın. Diğer anestezikler kullanılabilir. 2. Sadece utero retina electroporations için Isıtma yastığı açın ve bir bebek bezi ped ile örtün. Fosfat tamponu salin (PBS) ve ısıtma yastığı sıcak antibiyotik antimikotik çözüm (1:100) hazırlayın. Her baraj ~ 2 ml hazırlayın. Sıcak su banyosu steril filtrelenmiş PBS yerleştirin. 3. Sadece ex vivo retina electroporations Kabarcık DMEM/F12 25 ml% 95 oksijen / ≥ 2 saat için% 5 karbon dioksit: retina inkübasyon için oksijenli serum serbest orta (SFM) hazırlayın. 25 ml oksijenli ortamda, 0.25 g sığır serum albumini (BSA), 250 ul ITS ek ve 50 ul Penisilin-streptomisin çözüm ekleyin. Steril filtre, sonra çözüm BSA çözmek için çözüm karıştırın. Bu çözüm, her bir elektroporasyon deney için taze olarak yapılmalıdır. Otoklav bir heyecan mıknatıs ile 150 ml şişe metilselüloz 0.20 g: retina eksplant inkübasyon için SFM +% 0.4 metilselüloz orta hazırlayın. SFM (yukarıdaki gibi, köpüren olmadan) 50 ml hazırlayın ve otoklavlanmış metilselüloz şişe ekleyin. 4 ° C gecede bu çözüm karıştırın. Steril filtre bu çözüm ertesi gün, 4 ve mağaza ° C olan bu çözüm, yaklaşık 1 ay muhafaza edilebilir. Retina eksplant hasat (Bölüm 5) günü, retina eksplant kaplama için yemekler hazırlamak: Kat cam alt kültür kaplarına poli-L-ornitin 250 ul ≥ 2 saat boyunca 37 ° C. (Alternatif olarak, önceki gün yemekleri poli-L-ornitin ile kaplı olabilir ve 4 ° C'de bir gece inkübe) PBS, 10 mikrogram / ml laminin için DMEM/F12 200 ul kat yemekleri ile birkaç kez yıkayın yemekleri ≥ 2 saat 37 ° ° C. 37 bulaşık PBS ile birkaç kez yıkayın ° C ve eksplantlar kaplama için hazır olana kadar PBS bırakın. Sınır testlerde, poli-ornitin kat yemekleri, yukarıdaki gibi, sonra bir floresan işaretleyici ile birlikte protein ile faiz çanağı kat yarısı 2 saat için sınır (BSA, 1:800 konjuge Alexa Fluor 555) görselleştirmek için 37 ° C PBS ile yıkayın, daha sonra yukarıda açıklandığı gibi laminin ekleyin. Bölüm 2A: utero retina elektroporasyon in vivo E14.5 fare retinae içine DNA enjekte ve electroporating E13.5-E14.5 aşamada baraj içine 0.15 ml anestezik karışımı intraperitoneal (ip) enjekte edilir. Anne bir cerrahi anestezi düzlemine ulaşıncaya kadar 3-7 dakika sürer. Tam anestezi fare hindpaw sıkıştığı cevap olmamalıdır. Bu süre zarfında, pipetlemeyin parafilm ve küçük bir parça kesip ~ parafilm üzerine DNA çözüm 5 ul. 90 ° derecelik bir açıyla (metal tel) bir dalgıç bükün ve çekti micropippette takın. Pistonu kullanarak, mikropipet (diseksiyon mikroskobu kullanılarak bu işlem yardımcı olabilir.) DNA çözüm aspirat. Anne anestezi cerrahi düzlemine ulaştığında, daha sonra ısıtma yastığı onun dorsal yüzü aşağı, annenin karın ~ 2 inç bölge tıraş, elektrikli tıraş makinesi kullanın. Hazırlık alkol ped ile silerek traş alanı en az iki kez bir iyot ped izledi. Oftalmik Veteriner merhem annesi genel anestezi altında iken, gözlerde korneal ülserasyon önlemek için her gözün üzerine bir damla yerleştirin. Forseps, cilt kavramak ve periton açığa, karın kas ve deri yoluyla (yaklaşık 1 inç uzunluğunda) orta hat boyunca dikey bir kesi yapmak için makas kullanın. Forseps ile kaldırın ve periton karın boşluğunda (Şekil 1) ortaya çıkarmak için bu zarından benzer bir düşey kesi yapmak. Sonra iletişim kurmanızı ve saç ile kontamine olan karın içeriğini önlemek için gazlı bez ile cerrahi alanında asmakhayvan. Forseps ile deri ve periton geri çekin ve kesiden bir embriyo (en erişilebilir embriyo seçin) ayıklamak için diseksiyon spatula kullanın. 2 embriyolar arasında spatula yerleştirin ve karın boşluğuna doğru hafifçe dışarı embriyonik zincir çekin. Parmaklarınızla embriyonik zincir çekin. * Bu noktadan itibaren, embriyoların steril PBS ile sulu tutmak * Diseksiyon mikroskobu ve masaj retina yukarı bakacak şekilde bir embriyo altında onun yerine anne tutun, ısıtma yastığı. Daha kolay olan embriyolar electroporated takip etmek, ya da en medial veya lateral embriyo ile başlamanızı öneririz. Mikropipet baskın el atın ve diğer elinizle embriyo stabilize. Mikropipet ile delmek rahim duvarına ve amniyon kesesi yoluyla retina. Mikropipet keskinliğini bağlı olarak, adil bir miktarda rahim duvarına nüfuz baskı alabilir, ancak bir kez aracılığıyla mikropipet embriyo ve ideal retina girecek. Bu, embriyo girerken mikropipet derinliğini kontrol ve ölçmek için zor olabilir. Amniyotik sıvı kaçak ve embriyo ölümü ile sonuçlanan, giriş deliği genişleterek önlemek için zarı delinir sonra mikropipet hareket miktarını en aza indirin. Bu kanama ve embriyo ölümüne neden olacağı için, rahim duvarının delici kan damarlarının kaçının. Mikropipet retina girdiğini eminiz, retina içine DNA çözüm sınırdışı etmeye hazırız. Pistonu yavaşça bastırın ve aynı anda bu DNA mikropipet yol boyunca enjekte edilir mikropipet genellikle retinanın derin nüfuz olarak sağlanması, mikropipet geri. Retina iseniz, dış retina tabakası ve retina pigment epitel (RPE) arasında extraretinal uzaya 0.5 ul sınırdışı (mikropipet 1 ul onay işaretleri ile ölçülen). Amniyotik sıvı (Şekil 1) içine retina ve sızıntıları doldurarak yeşil boya dikkat etmelisiniz. Elektroporasyon kürekler ameliyat sırasında PBS-dolu bir Petri kabındaki tutulmalıdır. Yavaşça enjekte göz olarak aynı tarafta pozitif (+) kürek ile embriyonun baş tarafta kürekler. Bu embriyo ölüm amniyotik kese ve sonuç çıkacaktır, ılımlı bir miktar kafa stabilize etmek için basınç uygulayın, ancak çok sert basmayın. Elektrotlar yerine, 60 Hz frekansında 5 40 V, 50 ms kare bakliyat sunar. Anne mevcut deri ve kaslar için kaçan nedeniyle seğirme için alışılmadık bir durum değildir. Tekrar enjekte electroporated her bir embriyo için 7-9 adımları. Ben genellikle 4-8 DNA miktarına bağlı anne ortalama embriyolar, embriyo sayısı, anne durumu ve anestezi altında süreyi electroporate. Alternatif olarak, birden fazla embriyoların enjekte edilir ve sonra electroporated enjekte ve ayrı ayrı her bir embriyo electroporating karşı. Embriyoların electroporating sonra, karın boşluğuna geri embriyonik zinciri yerine forseps ve spatula kullanın. Karın boşluğuna ~ 2 ml antibiyotik antimikotik çözüm dökün. Hemostat ve forseps kesi ön kısmında bir çift düğüm ile başlayan, periton sütür ve kesi arka kısmına basit sürekli dikiş deseni ile devam etmek için kullanın. Sütür ve trim fazla dikiş bağlamak için son döngü kullanın. Kesi kapalı zımba, periton cilt ayırmak için dikkatli olmak, künt forseps ile kesi ön kısmı deri kaldırın. Cildin etrafında, zımba, dişlerin zımba yerleştirin ve bastırın. Kesi genellikle 5-7 zımba gerektirir arka sonu, kapalı zımbalama devam edin. Zımba etrafında yara alkol ped ile silin. Anne ısıtma yastığı (genellikle onu uyandırmak için 15-90 dakika arasında sürer) kurtarmak ve onun üzerinde rulo başladığında, yeni bir kafes karın tarafında onun yerine. Rahatsızlık devam ederse ağrı ve rahatsızlık en aza indirmek için, anne az sonra zaman noktalarında uyanış üzerine buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg, sc) alırsınız ve. Dehidratasyonu önlemek için, anne ile 1,0 ml serum fizyolojik subkutan (sc), akşam ve ertesi gün gerekirse ~-cerrahi sonrası 2-4 saat, ve tekrar enjekte edilir. Ameliyat sonrası 24 saat, annenin normal davranış yeniden ve içme ve düzenli yemek. Parça 2B: utero electroporated retinanın retina elektroporasyon Alma yılında E18.5 Embriyo başına ~ 5 ml PBS içinde% 4 paraformaldehid (PFA) hazırlayın. Perfüzyonları yerçekimine dayalı bir infüzyon sistemi veya bir şırınga pompası ile yapılabilir. (Alternatif olarak, E18.5 başkanları sadece bir gecede% 4 PFA dalmış olabilir.) Ile anne enjekte edilir.0.2 ml anestezik ip karıştırın ve o anestezi altında tam olduğundan emin olun. Zımba altındaki deri ve periton karın boşluğu ve rahim boynuzları maruz kesmek için bir makas kullanın. Electroporated embriyo çıkarın ve ventral tarafta pin up. Kalp, göğüs kafesi ve karın cilt, periton, diyafram ve lateral kısımları üzerinden maruz kesin. Pierce perfüzyon kurulum bağlı kelebek iğne ile sol ventrikül ve sağ atrium bir microscissors kesmek. Perfüzyon başlatın ve PFA ~ 60 saniye boyunca akmasına izin; kan sağ atriyuma çıkmalısınız ve perfüzyon başarılı olursa embriyo soluk haline gelmelidir. Embriyonun başını kesmek ve 15 ml konik flakon% 4 PFA baş toplamak. Electroporated embriyolar için bu yordamı tekrarlayın. Birkaç gün sonra PBS içinde yıkayın 4 geceleme% 4 PFA ° C başkanları tutun ve. Tüm embriyolar toplanan servikal dislokasyon ile anne Euthanize. Retinanın çıkarma PBS yıkar sonra, baş yukarı bakacak şekilde retina ile diseksiyon çanak pin ve PBS içinde batırmayın. RPE ortaya çıkarmak için retinanın tüm çevresindeki deri çıkarın. 26G1 / 2 iğne kullanarak, delinme lens RPE kavşakta ventral retina. Bu deliğin içine yerleştirin ve bir kenarı bir microscissors optik disk ventral retina ile dikey bir kesi yapmak. Bunu kaldırmak Bu yönlendirmek için retina sağlayacaktır. Ince nokta forseps ile RPE çıkarın. RPE bir forseps ile ventral kesi alın ve RPE sıkıca tutturulmuş RPE lens kavşak, özellikle retinanın RPE kabuğu diğer forseps kullanabilir. RPE çıkardıktan sonra, ince forseps ile objektif kavramak ve lens çıkarmak için yukarı ve dışarı çekin. Retina, optik sinir başı çevresinde forseps koyarak çıkarın ve retina çimdik. Için retinanın transfer PBS dolu, iyi retinae geldi parça hangi tutarak hangi başları. Kontralateral retinanın için 4-5 adımları tekrarlayın ve diğer tüm electroporated embriyolar. Olmayan enjekte retina immün için bir kontrol olarak hizmet vermektedir. GFP + hücreler (yeşil retinae) için tüm retinae tarama floresan bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Tüm GFP + retinae için elektroporasyon bu embriyo başarılı oldu ve bu retinae ve buna karşılık gelen bir beyin (görsel sistem bozulmamış) daha fazla analizi (yani kesit ve immün) (Şekil 1) işlenebilir . Bölüm 3a, ex vivo retina elektroporasyon enjekte ve in vitro E14.5 fare retinae içine DNA electroporating 0.2 ml anestezik karışımı ile E13.5-E14.5 aşamada anne anestezisi ve o anestezi altında tam olduğundan emin olun. Deri ve karın boşluğunda embriyolar maruz kesmek için makas kullanın. Forseps ile embriyonik zinciri yukarı kaldırın ve bağ dokusu tamamen anneden tüm embriyonik zinciri kaldırmak için kesti. DMEM/F12 ile buz üzerinde bir Petri kabındaki embriyonik zinciri yerleştirin. Servikal dislokasyon ile anne Euthanize. Bir microscissors ile tüm rahim duvarından geçerek kesin. Sonra her bir embriyo, plasenta kapalı, amniyon kesesi ve tutam çıkarmak için forseps kullanabilir. Her embriyo başını kesmek ve buz üzerinde DMEM/F12 başka bir Petri kabındaki başkanları toplamak. (Bkz. Bölüm 1), ağız pipetlemeyin veya piston pipetlemeyin kullanarak, istenilen miktarda DNA çözüm mikropipet doldurun. Bu protokolde, DNA, periferik dorsal retina içine enjekte edilecektir. Bir DNA enjeksiyon yeri ve elektrot kürekler konumlandırma ayarlayarak diğer retina bölgelerinde hedefleyebilir. PBS ile diseksiyon çanak bir kafa transferi ve baş sırt tarafında pin up. Retina üzerinde cilt kaldırmak için forseps kullanın. Holding mikropipet ~ 10 ° yatay konumda (dorsal retinanın eğrilik aslında paralel), bu yüzden, ucu RPE ve dış retina tabakasının arasında olduğunu RPE ile mikropipet itin. Bu uzaya ~ 0.1-0.4 ul DNA çözüm sınırdışı tüm alan yeşil sıvı dolum ve RPE de delikten dışarı sızdıran izlenebilir olmalıdır. Kontralateral retina enjeksiyon tekrarlayın. Dikkatlice ama hızlı bir şekilde başın ventral tarafta pozitif (+) kürek, pimleri kaldırmak ve başının etrafında (PBS dalmış tutmak baş) elektrot kürekler. 4 40-V, 60 Hz 50 ms darbe, sonra buz (Şekil 2) DMEM/F12 ile bir çanak içine başın arka tarafında yerde sunun. Tüm başkanları ve tüm DNA çözümleri için 5-7 adımları tekrarlayın. (Enjekte her biri farklı DNA çözümü için iyi bir) tamamladıktan electroporations sonra, 4-iyi bir çanak oksijenli SFM çözüm ~ 1.5 ml ekleyin ve buz üzerinde tutmak. Bir retina yukarı bakacak şekilde, bir baş DMEM/F12 ile bir diseksiyon çanak aktarın. (Ya da yan ters hedef bölge), ventral retina tutam ince forsepsve RPE bir delik gözyaşı. Özellikle lens retina kavşakta, retinanın RPE kabuğu forseps bir ucunu bu delikten. Bu inkübasyon sırasında kendi üzerine çökmeye retina neden olacaktır, çünkü retina kesmek ya da zarar vermeyin. (Lens dokunmadığınızdan), retina üssünde kıstırma, optik sinir retina pop RPE çıkardıktan sonra, forseps kullanabilir. Oksijenli SFM retinae aktarın. Başının üzerinde Flip ve kontralateral göz için tekrarlayın. Tüm electroporated başkanları için adım 9 tamamlayın. 40-48 saat 37 ° C'de oksijenli SFM retina inkübe edin. Bölüm 3b: ex vivo retina elektroporasyon Hasat ve GFP, kaplama + retina eksplantlar (2 gün sonrası elektroporasyon) DMEM/F12 bir Petri kabı kapağının içine iyi bir oksijenli SFM tüm retinae aktarın. Bir retina seçin ve retinanın GFP + (yeşil) bölümü görselleştirmek için floresan diseksiyon kapsamı kullanmak. Microscalpel ve forseps kullanma, incelemek ve sadece bir GFP + yığın retinanın kalır böylece retinanın olmayan GFP + kısmını atmak. GFP + retinanın özellikle seçmek için diseksiyon boyunca sürekli floresan ve düzenli ışık arasında geçiş yapmak için yararlı olur. DMEM/F12 ile iyi GFP + retina aktarın. Iyi bir tüm retinanın için 2. adımı tekrarlayın. Her bir DNA durumu (her biri farklı bir yanı), yeni bir Petri kabı ve DMEM/F12 orta kullanın. Bu GFP + retinae kaplama için küçük retina eksplantlar içine disseke olmalıdır. Diseksiyon kapsamında microscalpel küçük eksplantlar GFP + retinanın büyük bir parça kesti. Eksplantlarındaki dikdörtgen olmalı, uzunluk ve genişlik ~ 200-300 mikron. DMEM/F12 ile iyi bir bütün eksplantlar toplayın. Bir GFP + yığın retina ~ 4-10 GFP + doku büyüklüğüne bağlı retina eksplantlar üretmek gerekir. Tüm GFP + toplandı retina bölgelerinde için bu adımı tekrarlayın. Tüm GFP + retina eksplantlar hazırladıktan sonra, SFM 250 ul +% 0.4 metilselüloz kültür yemekleri laminin kaplı (bkz. Bölüm 1) (4 ° C'de muhafaza) Transferi 4-8 GFP + kültür çanak ve hafifçe yarım çanağı merkezi ve kenar arasında yer eksplantlar bir çokgen, eksplantlar düzenlemek için forseps kullanabilir eksplantlarında. RGC katman eksplant hangi tarafta belirleyin. Bazen RPE kristalleri karşı tarafa RGC katmanı olduğunu belirterek, dış retina tabakasının bağlı kalır. Buna ek olarak, RGC bir tarafı genellikle uygun eksplant yönde yardımcı olabilecek bazı hücresel enkaz vardır. RGC aşağı tabakası ile forseps, cam lamel uyacaktır böylece eksplant merkezinde sıkıca bastırmak için kullanın. Forseps eksplant bir girinti görülebilir, bu normaldir. Bir kültür çanak tüm eksplantlarında kaplama sonra, 37 transfer ° C inkübatör. Retina aksonlar kaplama sonrası ilk 4-6 saat gözlenir ve eksplantlar birkaç gün boyunca sağlıklı kalır, ama önemli üremesine yol 24 saat sonra ortaya çıkabilir. Eksplantlarındaki 30 dakika ile immunohistokimyasal (Şekil 2) için% 4 PFA ile sabit, çok sayıda in vitro tayinlerde için kullanılabilir. Sınır Testi Alternatif olarak, (bkz. Bölüm 1) sınır tayini için hazırlanmış olup, bir çanak 4 GFP + eksplantlar aktarın. Sınırın yerini yakın, çanak merkezi bir dikey çizgi eksplantlar düzenleyin. Floresan diseksiyon mikroskobu, plaka altında eksplantlar floresan sınır ~ 50-150 mm böylece. RGC aksonlar için yeterli zaman sağlayan, sınır substrat ulaşmak için 24 saat 37 ° C'de yemekleri inkübe edin. Eksplantlarındaki immün (Şekil 2) takip 30 dakika boyunca% 4 PFA sabit olabilir. Temsilcisi sonuçları