Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität
Summary
Dieser Artikel beschreibt ein neuartiges Protokoll und Reagenz-Set für empfindliche Messung der neurotoxischen Wirkungen von Verbindungen und Behandlungen auf Co-Kulturen von Neuronen und Astrozyten mit High Content Analyse entwickelt. Die Ergebnisse zeigen, dass High Content Analyse eine spannende neue Technologie für die Neurotoxizität Beurteilung darstellt.
Abstract
High Content Analyse (HCA)-Assays kombinieren Zellen und Nachweisreagenzien mit Automated Imaging und leistungsfähige Bildanalyse-Algorithmen, so dass die Messung von mehreren zellulären Phänotypen in einem einzigen Assay. In dieser Studie verwendeten wir HCA eine neuartige Assays für Neurotoxizität zu entwickeln. Neurotoxicity Bewertung stellt einen wichtigen Teil der Bewertung der Arzneimittelsicherheit, wie auch als ein wichtiger Schwerpunkt der Bemühungen im Umweltschutz. Darüber hinaus ist Neurotoxizität auch ein gut angenommen<em> In-vitro-</em> Marker für die Entwicklung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson. Vor kurzem hat die Anwendung von HCA zu neuronalen Screening berichtet worden. Durch die Kennzeichnung neuronalen Zellen mit βIII-Tubulin, können HCA Untersuchungen liefern hohen Durchsatz, nicht subjektiv, quantitative Messungen von Parametern wie neuronale Zahl, Neuriten zählen und Neuritenlänge, von denen alle neurotoxische Wirkungen hinweisen können. Allerdings bleibt die Rolle der Astrozyten in diesen Modellen unerforscht. Astrozyten sind eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung des zentralen Nervensystems (ZNS) Homöostase, und sind sowohl mit Neuroprotektion und neurodegradation, wenn sie als Reaktion auf toxische Substanzen oder Erkrankungen aktiviert sind verbunden. GFAP ist ein Zwischenprodukt Filament Protein vorwiegend in den Astrozyten des ZNS exprimiert. Astrozytäre Aktivierung (Gliose) führt zur Hochregulation von GFAP, häufig von Astrozyten Proliferation und Hypertrophie begleitet. Dieser Prozess der reaktiven Gliose ist als ein früher Marker der Schädigung des Nervensystems vorgeschlagen worden. Die traditionelle Methode zur Quantifizierung GFAP wird durch Immunoassay. Dieser Ansatz wird durch die Unfähigkeit, Informationen über die zelluläre Lokalisation, Morphologie und Zellzahl bieten begrenzt. Wir haben festgestellt, dass HCA verwendet werden könnten, um diese Einschränkungen zu überwinden und gleichzeitig zu messen mehrere Funktionen mit Gliose in Verbindung gebracht werden – Veränderungen in GFAP-Expression, Astrozyten Hypertrophie und Astrozyten Verbreitung – in einem einzigen Assay. In Co-Kultur-Studien haben gezeigt, dass Astrozyten Neuronen gegen verschiedene Arten von toxischen Beleidigung zu schützen und entscheidend beeinflussen neuronale Überleben. Neuere Studien legen nahe, dass die Verwendung von Astrozyten in einer<em> In-vitro-</em> Neurotoxizität Testsystem kann sich als relevant für die menschliche ZNS-Struktur und Funktion neuronaler Zellen als allein. Dementsprechend haben wir eine HCA Test für Co-Kultur von Neuronen und Astrozyten entwickelt, bestehend aus Protokollen und validiert, target-spezifischen Nachweisreagenzien zur Profilierung βIII-Tubulin und sauren Gliafaserproteins (GFAP). Dieser Assay ermöglicht die gleichzeitige Analyse von Neurotoxizität, Neuritenwachstum, Gliose, neuronale und astrozytären Morphologie und neuronalen und astrozytären Entwicklung in einer Vielzahl von zellulären Modellen, was einem neuartigen, nicht-subjektive, High-Throughput-Assay für Neurotoxizität Beurteilung. Der Test birgt ein großes Potenzial für eine verbesserte Erkennung von Neurotoxizität und eine verbesserte Produktivität der neurowissenschaftlichen Forschung und Wirkstoffentwicklung.
Protocol
Discussion
Bis heute wurden in vitro Experimente zur Neurotoxizität Risikobewertung mit gemischten Kulturen von Neuronen und Astrozyten Studie beschränkt. Es ist gut angenommen, dass Gliazellen integraler bei der Bereitstellung von Raum-und Stoffwechsel-Unterstützung Neuronen sind, und spielen eine entscheidende Rolle bei der Modulation der neuronalen mehrere Funktionen, einschließlich neuronalen Migration, Differenzierung und synaptische Aktivität. Gliazellen Astrozyten auch setzen Zytokine und andere lösliche Faktoren, die in der Lage sowohl induzieren unerwünschten Reaktionen in der Umgebung neuronales Gewebe, sowie die Förderung der neuronalen Toleranz vieler Giftstoffe. Demonstration der Tiefe des neuronal-glialen Interaktionen, in Co-Kultur-Studien haben gezeigt, dass Astrozyten Neuronen gegen die Toxizität von oxidativem Stress zu schützen, während Beeinträchtigung der Astrozyten-Funktionen, wie die Instandhaltung von antioxidativen Abwehr und zellulären Energie, hat sich gezeigt, entscheidend beeinflussen neuronale Überleben. Neuere Studien legen nahe, dass die Verwendung von Astrozyten de einem in vitro Neurotoxizität Testsystem kann sich als relevant für die menschliche Zentralnervensystem Struktur und Funktion neuronaler Zellen als allein. Trotz des wachsenden Bewusstseins über die physiologische Bedeutung der neuronalen-astrozytären Interaktionen, ist es bislang schwierig, quantitative Analysen dieser Interaktionen in intakten Zellen durchzuführen. Das Aufkommen von High Content Screening ermöglicht die Entwicklung von leistungsstarken neuen Assays an diese Adresse.
In dieser Studie haben wir gezeigt, dass quantitative Analysen von mehreren neuronalen und astrozytären Phänotypen in einem einzigen Assay ermöglicht werden, indem HCA. In primären Neuronen haben wir quantitative Messungen der Neurotoxizität Marker wie neuronale Zahl, Neuriten zählen und Neuritenlänge durchgeführt. In Astrozyten, ist reaktive Gliose einen bekannten Biomarker für Neurotoxizität, durch Veränderungen in GFAP-Expression, Astrozyten Anzahl und Astrozyten Morphologie charakterisiert. Wir haben gezeigt, dass jeder von diesen Endpunkten ohne weiteres über HCA beurteilt werden. Diese Studien unterstützen das Konzept, dass HCA von neural-spezifischen Biomarkern als Teil einer Batterie konnte in vitro-Tests verwendet werden, um schnell Bildschirm eine große Anzahl von Chemikalien für die neurotoxischen Endpunkte.
Millipore ist HCS222 High Content Analyse-Kit für Co-Kultur von Neuronen und Astrozyten ist aus hochwertigem Nachweisreagenzien und Protokolle für die gleichzeitige Profilierung βIII-Tubulin und sauren Gliafaserproteins (GFAP) in einer Vielzahl von zellulären Modellen der Neurotoxizität zusammen. Die hoch-validierte Reagenzien dieses Kits erlauben dem Benutzer, Tests zu standardisieren, zu minimieren Assay-to-Assay-Variabilität und reproduzierbar zu erzeugen Bilder mit einem hohen Signal-zu-Untergrund-Verhältnis.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Dr. danken. Rick Ryan, Umesh Patel, Jeff Till, Matthew Hsu, Jehangir Mistry und Michele Hatler für die Unterstützung während der Entwicklung dieser Projekte und Protokolle.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201672 | 1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X | Part No. CS201649 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201671 | 1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X | Part No. CS200437 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Hoechst HCS Nuclear Stain, 200X | Part No. CS200438 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X | Part No. CS200434 | 1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Immunofluorescence Buffer, 1X | Part No. CS200435 | 1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Wash Buffer, 1X | Part No. 2007643 | 1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components |
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| Acrylamide (Control Compound), 10X | Part No. CS201679 | 1 vial containing 500 µL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component |
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| Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X | Part No. CS201730 | 1 vial containing 500 µL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components |
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| K-252a (Control Compound), 250X | Part No. CS201741 | 1 vial containing 100 µL of 250 µM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component |
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| DMSO for Compound Serial Dilution | Part No. CS200441 | 1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Compound Dilution Buffer | Part No. CS200442 | 1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Plate Sealers | Part No. CS200443 | 10 each Millipore HCS222 Kit Components |
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| tissue culture-treated black/clear bottom microplates | ||||
| HCS imaging/analysis system |
References
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