一个神经元和星形胶质细胞共培养检测神经毒性的高含量分析

细胞制备： 直到〜70％至80％融合（细胞检测，文化生长介质中的星形胶质细胞神经​​元/播种前，除非细胞从解冻或隔离直接播种）。 通过方法适合于细胞类型的兴趣分离细胞培养瓶/板。如果有必要，大衣检测井盘与D -聚赖氨酸或细胞外基质蛋白，增强细胞的粘附。联合培养的星形胶质细胞和神经元可能同时或顺序号种子。对于连续的种子队，电镀的第一层作为“基础”的星形胶质细胞是建议，由神经元的电镀和分化，如有必要。细胞类型，随后的培养时间，感兴趣的参数进行适当调整细胞密度等，根据文化，年龄，细胞来源和播种密度，小学文化的差异很大，GFAP表达或突起生长增殖率 – 是很重要的表征和优化您的电池系统，提供为您的实验模型中大多数生物的相关性，以及提供有效的成像，分割和使用的HCS（见图1）分析。加入细胞板（种子细胞可能在90μL的媒体，以促进毒素治疗，在下面的步骤3中所述）后，使板在室温下在水平表面上坐15-30分钟，使即使是细胞分布。在此期间，孵育细胞生长介质中至少24小时（37 ° C / 5％的CO 2），然后切换到分化培养条件下（例如，低血清/ NGF对PC12细胞），适当的。继续文化，直到细胞达到所需的合流或分化水平，改变在适当的时间间隔为细胞类型的媒体。 细胞治疗（控制化合物，测试化合物等）可在任何时候，这种文化期间，利息的处理时间，当然适当。丙烯酰胺，双氧水和K – 252A是作为神经毒性控制化合物。提供了充足的试剂是重复的12点的剂量反应曲线（包括一个 生署2 O或DMSO控制范围内设定的剂量反应）所有五个96孔板。该化合物是提供250X的浓度（K – 252A，假设为1μm的最大处理）或10X（丙烯酰胺和过氧化氢，假设分别为100毫米和10毫米，最大的治疗）。推荐的治疗准备工作涉及半的日志（1：√10）连续稀释250X化合物在DMSO，复方稀释液稀释10X（10X控制卫生署2的化合物可能会连续稀释后，直接在无菌的dh 2 O或复方稀释液）。每次治疗10μL，然后可能被加入到90μL，每口井已经存在的文化传媒，作最后的1X浓度（0.4％DMSO或10％DH 2 O ）。样本数据是在37 ° C之前，以固定为24或96小时复方治疗。 细胞固定和免疫荧光染色： 注：染色时间约2.5小时后固定。不要让井干染色步骤之间。试剂的愿望和豁免应进行低流速，以减少由于流体剪切任何细胞的损失 。 所有建议“是指每以及”卷单井的96孔微孔板。所有“建议每96孔板”卷包括液体处理量损失超过25％。所有的染色步骤是在室温（RT） 。所有缓冲区和抗体的解决方案是稳定的，在室温下至少24小时。 在文化时期的结束，预温HCS固定的解决方案（2X）室温（RT）或37 ° C，如果需要的话（12 mL/96-well板）。在化学通风柜，加入100μL/孔直接向文化传媒，并允许在室温下30分钟的修复。删除固定液/毒素包含媒体，并在符合危险废物的规定处置（见MSDS）。如果立即着手染色，冲洗两次，每孔200μL的HCS免疫缓冲区。另外，如果板沾在稍后的时间，冲洗两次与200μL洗涤缓冲液，然后离开井和存储板，紧紧密封在4 º C，直到染色第二次冲洗量。 如果固定样本已储存在4℃染色前，200μL的HCS免疫缓冲区冲洗两次，然后进行染色协议。 准备工作βIII兔抗微管蛋白/鼠标抗GFAP HCS（6 mL/96-well板）主要抗体的解决方案如下：每个解冻的抗体加入60微升至5.88毫升的HCS免疫缓冲区。拌匀。删除以前的免疫缓冲液冲洗。加入50μL小学抗体溶液到每口井和1小时在室温下孵育。 删除第一抗体解决方案。用200μLHCS免疫缓冲区冲洗三次。 准备工作的HCS中抗体/赫斯特的HCS核染色（6 mL/96-well板）的解决方案如下：每个解冻二级抗体加入30μL和30μL解冻赫斯特的HCS核染色5.91毫升的HCS免疫缓冲区。拌匀，由轻保护的解决方案。删除以前的HCS免疫缓冲区冲洗。加入50μL的HCS中抗体/赫斯特的HCS核染色溶液，孵育1小时，在避光RT。 删除的HCS中学抗体/赫斯特HCS核染色解决方案。用200μLHCS免疫缓冲液冲洗两次。 删除以前的HCS免疫缓冲区冲洗。用200μL的HCS洗涤缓冲液冲洗两次，留下第二次冲洗量在井。 立即密封板和形象，或存放在4℃板避光，直到成像准备。 图像采集和分析： 染色板的成像和分析，可能是各种可用的HCS平台，包括细胞分析仪（通用电气医疗集团），ArrayScan（ThermoFisher科学）或歌剧（Perkin Elmer公司）后执行。在表1提供的成像和分析的一些指导方针： HCS222图像采集准则 检测试剂 物镜 激发滤光片范围[峰/带宽（NM）] 排放过滤范围[峰/带宽（nm）] 赫斯特的HCS核染色 20X 四十○分之三百六十○ 四十零分之四百六十○（或五十分之五百三十五如有必要） HCS二抗，FITC标记的驴抗兔IgG 20X 四十零分之四百八五十零分之五百三十五 HCS二抗，Cy3标记的驴抗小鼠IgG 20X 五十零分之五百三十五五十○分之六百 HCS222图像分析准则 晶胞参数 检测 分割/测量 理由 细胞数，核特性赫斯特的HCS核染色核区（460 nm发射通道）。计算原子核的数目。 DNA含量（核武器强度）或核领域的分析，也有可能。 使用细胞数，核特性，以确定细胞的损失，毒性表型等，可以“过滤器”βIII-微管蛋白或GFAP表达获得单独的神经元和星形胶质细胞计数/刻画（强烈推荐）的原子核。 βIII-微管蛋白的表达，突起生长 HCS二抗，FITC标记的胞内区（535 nm发射通道）。 FITC标记的信号可能是用来区分突起的神经元细胞体（例如，通过最小/平均细胞的身体部位，最小/最大突起的长度和宽度）。确定参数，如总长度突起，突起计数/细胞等突起生长的测量可在神经细胞分化过程中或化学性损伤，疾病状态等调制可以“过滤”βIII-微管蛋白的表达，获得不同的神经元的特性（强烈推荐）的胞体。 GFAP的表达，星形胶质细胞区 HCS二抗，Cy3标记的共轭胞内区（600 nm发射通道）。 Cy3标记的信号可以用来定义星形胶质细胞的细胞质分割。确定参数，如平均细胞质的信号强度，细胞面积，等 GFAP的表达和星形胶质细胞面积的星形胶质细胞的发展，或作为一种化学性损伤，疾病状态的结果可能会在调制，等“过滤器”与GFAP的表达，获得独特的星形胶质细胞的特性（强烈推荐）的细胞体。 表1图像采集和分析指南- HCS222βIII-Tubulin/GFAP（联合培养）含量代表性的成果： 图1。 βIII-微管蛋白和GFAP immunofluorescence的混合大鼠神经细胞培养。 镀前几天神经播种在文化，星形胶质细胞所产生的原发性大鼠海马神经元或大鼠PC12细胞的原代大鼠海马星形胶质细胞共培养。主神经元培养一个额外的11天，而PC12s培养分化条件下（低血清/ NGF）增加2天。根据HCS222检测协议进行处理，固定和免疫细胞。细胞在细胞分析仪1000（3.3），20X（主神经元）或10X（PC12）物镜成像上的GE和分析细胞分析仪1000工作站（3.4）轴突生长和多目标分析算法中使用了GE顶板。赫斯特的HCS核染色（蓝色），βIII-微管蛋白（绿色）和GFAP（红色）荧光的融合图像。单独分析βIII-微管蛋白的荧光通道，允许突起生长分割（中间面板：概述蓝（初级神经元的胞 ​​体）或黄色（PC12），绿色（主神经元）或淡蓝色（PC12 ）的突起）。 GFAP的渠道分析允许星形胶质细胞的分割（ 底部面板：细胞核，细胞质蓝色概述绿色）。 GFAP的原代大鼠海马神经元/星形胶质细胞的共同文化的分割演示的能力，区分核/胞体，GFAP（+），（绿色概括）和GFAP（ – ）（红色），使不同的细胞计数神经元和星形胶质细胞混合培养设置。 图2。海马神经元/星形胶质细胞共同培养有毒强调的原代大鼠的剂量反应。 原代大鼠海马星形胶质细胞接种于96孔板（六）在生长介质和培养6天。原代大鼠海马神经元（直接从解冻），然后上方的镀前的星形胶质细胞，接种于培养基中培养11天。细胞经连续稀释的丙烯酰胺或过氧化氢的文化在过去24小时（最大浓度= 100mm和10mm的分别）。根据HCS222检测协议进行处理，固定和免疫细胞。细胞成像上的GE细胞分析仪1000（3.3），20X（10场/孔）和分析（核/胞浆/突起分割）使用GE的细胞分析仪1000工作站（3.4）轴突生长和多目标分析算法。所列数据是平均± SEM，N = 3。多个参数（突起生长，GFAP的强度，星形胶质细胞面积和神经元或星形胶质细胞计数）为剂量依赖性的发展趋势进行了调查。