Este procedimiento se describe cómo establecer cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina y es seguida por la transfección utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXCell.
Cada vez es más evidente que la electroporación es la forma más eficaz para introducir ADN plásmido o siRNA en células primarias. El sistema de electroporación Gene Emisores MXcell y Gene tampón de electroporación Emisor se han desarrollado específicamente para transfectar ácidos nucleicos en células de mamíferos y difíciles de transfectar células, como el vídeo cells.This primaria y madre muestra cómo establecer cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina , y luego a prepararse para la electroporación en el sistema de MXcell. Comenzamos por el aislamiento del fémur y la tibia. La médula ósea de ambos fémur y la tibia se recolectan y las culturas establecidas. Cultivos de células de médula ósea son entonces transfectadas y analizados.
A medida que más información sobre el genoma surge y nuevas herramientas como siRNA desarrollados, el uso de células fisiológicamente relevantes se ha convertido cada vez más importante para mejorar nuestra comprensión de los caminos de la enfermedad, las interacciones proteína-proteína, y la transducción de señales. Las células primarias se obtienen directamente de los tejidos o fluidos y cultivadas in vitro. Estas células se pueden manipular de muchas maneras, incluso mediante la introducción de material genético exógeno. Cada vez es más evidente que la forma más eficaz para introducir ADN plásmido o siRNA en las células primarias es la electroporación.
Electroporación expone las células a pulsos eléctricos con el fin de aumentar de forma transitoria la permeabilidad de la membrana celular, permitiendo así que los ácidos nucleicos exógenos a entrar en la célula. Este método de transfección se puede optimizar para dar cabida a las diferencias entre los tipos de células diferentes / líneas y, por tanto, puede ser usado para transfectar las células cebadas, así como cualquier otro hueso derivadas de la médula de la célula. Además, a diferencia viral mediada por transfección, electroporación no impone límites en el tamaño de ADN transfectadas, ni requieren una preparación. A diferencia de los lípidos mediada por transfección, electroporación puede ser menos tóxico y no resulta en la captura endosomal del ácido nucleico transfectadas.
Bio-Rad ha desarrollado el sistema de electroporación MXcell específicamente para estas células. la MXcell le permite variar las condiciones para maximizar su eficiencia de transfección y viabilidad de las células. Con el fin de optimizar la eficiencia de transfección y reducir al mínimo la muerte celular, una multitud de parámetros de electroporación, incluyendo voltaje, capacidad, resistencia y duración del impulso se puede ajustar y evaluar.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Gene Pulser MXcell Electroporation System | Bio-Rad | 165-2670 | ||
Gene Pulser Electroporation Buffer | Bio-Rad | 165-2677 |