Apenas genes que são transcritos em RNA mensageiro (mRNA) estão ativos ou expressos. Os cientistas podem, portanto, extrair o mRNA das células para estudar a expressão genética em diferentes células e tecidos. O cientista converte o mRNA em DNA complementar (cDNA) através de transcrição reversa. Como o mRNA não contém intrões (regiões não codificantes) e outras sequências regulatórias, o cDNA—ao contrário do DNA genómico—também permite que os investigadores determinem diretamente a sequência de aminoácidos do peptídeo codificado pelo gene.
O cDNA pode ser gerado por vários métodos, mas uma maneira comum é primeiro extrair o RNA total das células e, em seguida, isolar o mRNA dos tipos mais predominantes—RNA de transferência (tRNA) e ribossómico (rRNA). O mRNA eucariótico maduro tem uma cauda poli(A)—uma sequência de nucleótidos de adenina—adicionada ao seu terminal 3’, enquanto que outros tipos de RNA não. Portanto, uma cadeia de nucleótidos de timina (oligo-dTs) pode ser anexada a um substrato, como uma coluna ou contas magnéticas, para emparelhar as bases especificamente com as caudas poli(A) do mRNA. Enquanto que o mRNA com cauda poli(A) é capturado, os outros tipos de RNA são lavados.
Em seguida, a transcriptase reversa—uma enzima de DNA polimerase de retrovírus—é usada para gerar cDNA a partir do mRNA. Uma vez que, como a maioria das DNA polimerases, a transcriptase reversa pode apenas adicionar nucleótidos ao terminal 3’ de uma cadeia, um primer poli(T) é adicionado para se ligar à cauda poli(A) para fornecer um ponto de partida para a síntese de cDNA. A cadeia de cDNA termina em um hairpin loop. O RNA é então degradado—comumente com tratamento alcalino ou enzimas RNase—deixando o cDNA de cadeia simples intacto.
Uma segunda cadeia de DNA complementar ao cDNA é então sintetizada pela DNA polimerase—muitas vezes usando o hairpin loop da primeira cadeia do cDNA ou uma porção cortada do mRNA como primer.
O cDNA de cadeia dupla resultante pode ser inserido em vectores bacterianos ou virais e clonado usando técnicas padrão de biologia molecular. Uma biblioteca de cDNA—representando todos os mRNAs nas células ou tecidos de interesse—também pode ser criada para investigações adicionais.
