Le peroxyde d’hydrogène (H2,O2) est à la fois une source de dommages oxydatifs et une molécule de signalisation. Ce protocole décrit comment mesurer le H 2 O2mitochondrial à l’aide de HyPer7 (mtHyPer7) ciblant les mitochondries, un biocapteur ratiométrique génétiquement codé, chez la levure vivante. Il détaille comment optimiser les conditions d’imagerie et effectuer des analyses cellulaires et subcellulaires quantitatives à l’aide d’un logiciel disponible gratuitement.