基因枪子弹的制备和神经元的基因枪转染切片文化

基因枪转染议定书“ 让子弹子弹长达6个月，但可能会减少2-3个月后开始转染效率。干燥剂颗粒的存在，子弹应保存在4 ° C。始终让闪烁瓶，存储在其中的子弹，温暖的室温打开小瓶之前。 在开始之前已经做好准备： 亚精胺（0.05M） 氯化钙 （1M） 乙醇（100％高档，未开封的一瓶） 蒸压H 2 0 DNA转染聚乙烯吡咯烷酮（PVP – 20毫克/毫升的股票） 2 × 15 ml锥形（2/bullet设置） 管（X – 30英寸/子弹设置削减到1） 闪烁瓶（1/bullet集） 干燥颗粒 10 ml注射器W /到底管准备管： 干〜30英寸的管道，在管站W / N 2气体（0.4压力）至少20分钟（约2英寸扩展超越权利O形圈） 。 沉淀DNA的黄金珠： 准备将在50μmL离心管总量（最高50微克总DNA）转染的DNA 称取6-8毫克的黄金和转让的离心管加入100μL0.05M亚精胺的黄金和超声20秒加入50微升的DNA的黄金/精胺涡（周围设置5）W /盖打开新增下降明智的100μL1M 氯化钙 超声简要（<5秒） 在室温为10分钟，允许沉淀超声简要准备在超声PVP的解决方案： 做稀PVP的解决方案，为每个子弹15 ml锥形，3.5mL稀释的PVP（100毫升3.5％的乙醇添加7.5μL20mg/ml PVP的股票） 乙醇漂洗黄金珠： 全速离心10秒中的微量黄金珠弃上清，但保留的少量液体黄金珠上洗净用1ml乙醇的3倍，超声简要每一次，如有必要悬浮金/ DNA在PVP的解决方案： 重悬在3.5毫升稀释PVP /乙醇溶液200μL的黄金颗粒涡街的黄金颗粒重悬（如果有必要简要超声） 金/ PVP溶液200μL转移到一个新的15 mL锥形继续以这种方式，加入200μL的PVP一次，直到所有的黄金已转移至15 mL锥形，最终体积为3.2毫升涂层管： 关闭管站N 2和取出干管将干管10毫升注射器大力摇晃15 mL锥形填充金/ PVP 放置在金/ PVP溶液管材年底和吸慢慢小心，以避免气泡从油管两端保留1〜2英寸干随着油管仍然附着在注射器和充满黄金/ PVP的解决方案，小心地进入车站的油管回马克油管的解决方案坐在两端让黄金与注射器连接5分钟解决吸的解决方案非常缓慢拉动注射器使落户金留下（确保不反洗） 拔下注射器旋转90 °，让我们坐2秒旋转180 °，让坐在另2秒旋转管，持续5秒打开了N 2，使阀门读取0.4 – 0.5和旋转镀金管，而干燥5分钟。 切割管材： 取出油管从油管准备站和切断两端的标志。 把管斩波器的下一个标记的闪烁瓶中赶上削减墨盒管放置在管斩波器和切割油管清洁剃须刀闪烁瓶中放置在一个干燥颗粒商店墨盒在4 ° C 拍摄组织切片培养片拍摄时，重要的是聘请一个相对无菌的技术，以避免污染。请记住，子弹两套拍摄时，两个不同的结构，可以装到同一盒支架，但桶内衬和屏幕之间的结构应改变。 在开始之前已经做好准备： DNA的子弹（让闪烁瓶中的热烈开幕前室温） 组织切片太阳神基因枪氦气罐用基因枪软管连接</ LI> 盒支架在内衬塑料桶与O形圈扩散器（修改） 漫射屏镊子预备基因枪： 使用镊子放入镀金塑料匣盒支架。 先推回锁放置到基因枪盒支架安全锁盒支架获得一个O形环和安全的地方扩散屏幕每桶班轮基因枪拧入每桶班轮用基因枪射击培养切片： 戴上耳罩基因枪插入软管连接氦气罐打开水箱压力为180 PSI的拍摄到空气中的空白，以消除从扩散器屏幕上的灰尘或碎片。要拍摄的枪，第一压低，直到枪鸣音安全联锁按钮，然后扣动扳机。 拍摄后的空白，从孵化器中取出切片“ 预先枪首先构造拍摄扩散屏幕约0.5 – 1英寸片推进井间的墨盒。 去年以及拍摄后，将切片放入培养箱脱离氦软管枪之前，关闭气体和释放压力拧开桶内衬，并取出硒鼓和使用的炮弹清洗墨盒持有人及桶内衬： 放置盒，桶内衬，并用肥皂水在一个烧杯中的扩散屏幕将烧杯中的浴缸sonicator和20分钟的超声彻底用清水冲洗干净，肥皂残留物都将被删除，直到所有 70％乙醇中浸泡了一个小时干纸巾上放置过夜干在随后的基因枪转染可以重复使用清洁盒，桶内衬和屏幕基因枪法转的故障排除技巧 基因枪法转，有时可能会导致不理想的转染条件 。 它可以导致过少或过多的脑细胞转染，过高或过低的表达水平，或可能会导致组织切片成为普遍不健康 。 往往是不健康片压力爆炸的结果。 这里有一些提示，以获得最佳的转染的组织切片。 如果片似乎是不健康的（或如果有太多的细胞转/片），请尝试： 拍摄距离增加 煤气罐上的压力下降 减少的数量的黄金切割出在Bio – Rad扩散的中心，并取代与扩散屏幕​​中心。 如果太少的细胞转染，尝试： 减少拍摄距离煤气罐上的压力越来越大 增加黄金数量组织切片的数目增加/ 确保在每桶班轮的O型圈是否完好。 如果你得到太多和太少的细胞在相同的拍摄 ，确保转片： 你是拿着枪对称以上的黄金是均匀地涂在管内。 （如果你已经看到了黄金线 ，从油管以更快的速度绘制出上清液，一旦黄金已落户和旋转，然后再打开氮气的黄金时间，另一方面， 如果你正在黄金裸奔这可能是由于过多的水分在子弹使曝光：确保您使用的是一瓶未开封的乙醇，管涂装前彻底干燥，和您封顶盖和及时准备的子弹）。 如果转染效率似乎最佳（＃细胞转/片），但表达水平似乎过高或过低： 调整比例DNA黄金。 （例如，如果它太低保持的黄金数量， 但增加 DNA的量。） 调整拍摄和数据收集之间的时间量双转的情况下，如果你得到的太少，表达你的构造之一，以适当的方式调整两种结构的比例，并确保这两个构造相同的发起人，以确保一发起人不会出其他竞争。