El protocolo presentado aquí implica el perfil polisomal para aislar translatoma, ARNm asociados con ribosomas, en ARN polisomales y no polisomales de Arabidopsis a través de la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Este método demuestra la eficiencia de traslación de Arabidopsis sometida a estrés térmico.
El control traslacional de diferentes genes bajo estrés térmico es un paso crítico para la adaptación de las plantas al medio ambiente. La evaluación de las actividades traslacionales de varios genes puede ayudarnos a comprender los mecanismos moleculares que subyacen a la resiliencia de las plantas, contribuyendo al desarrollo de cultivos con mayor tolerancia al estrés frente al cambio climático global. Este artículo presenta una metodología detallada para evaluar la eficiencia de la traslación a través del perfil de polisomas en plantas expuestas a estrés térmico. El procedimiento se divide en tres partes: tratamiento de estrés térmico para Arabidopsis, prueba de eficiencia de traducción utilizando perfiles de polisomas y cálculo de la eficiencia de traducción mediante el aislamiento de ARN polisomal y no polisomal basado en el perfil. En la primera parte, las plantas de Arabidopsis se someten a condiciones controladas de estrés térmico para imitar los desafíos ambientales. El tratamiento consiste en exponer las plantas a altas temperaturas durante períodos específicos, lo que garantiza una inducción de estrés constante y reproducible. Este paso es crucial para estudiar las respuestas fisiológicas y moleculares de la planta al estrés por calor. La segunda parte consiste en la prueba de eficiencia de traducción utilizando perfiles de polisomas. Los polisomas se extraen mediante centrifugación en gradiente de sacarosa, que separa los ARNm en función de la carga ribosómica. Esto permite examinar la ocupación de los ribosomas en los ARNm, proporcionando información sobre los mecanismos de control de la traducción en condiciones de estrés. En la tercera parte, el ARN se aísla de fracciones polisomales y no polisomales. El ARN de pico se utiliza para medir con precisión la cantidad de ARN en cada fracción. El cálculo de la eficiencia de traducción se realiza comparando la distribución de los ARNm a través de estas fracciones en condiciones normales y de estrés térmico. Las actividades de traducción de genes específicos se evalúan aún más mediante la realización de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) con ARN asociado a ribosoma y ARN total. Esta metodología se centra exclusivamente en los efectos del estrés térmico, proporcionando un protocolo detallado para analizar la regulación traslacional en las plantas.
La traducción es crucial para que los organismos sinteticen proteínas funcionales a partir de ARNm, apoyando las funciones celulares esenciales y los procesos biológicos como el metabolismo y la señalización y permitiendo las respuestas al estrés. Sin traducción, las células no pueden producir proteínas vitales, lo que afecta su estructura, función y regulación, lo que afecta el mantenimiento de la vida y fomenta la diversidad biológica 1,2. Por lo tanto, el estudio de la eficiencia traslacional de las plantas es crucial. La traducción implica varios pasos esenciales. En primer lugar, la iniciación se produce cuando el ARNm se une a un ribosoma, facilitada por factores de iniciación como los eIFs en eucariotas, que identifican el codón de inicio, normalmente AUG. A continuación, la elongación procede a medida que las moléculas de ARN de transferencia (ARNt), cada una de las cuales lleva aminoácidos específicos, se unen secuencialmente al ribosoma. Los enlaces peptídicos se forman entre los aminoácidos adyacentes, alargando la cadena polipeptídica de acuerdo con la secuencia de ARNm. Finalmente, la terminación se inicia al encontrar un codón de parada (UAA, UAG o UGA), reconocido por factores de liberación que incitan al ribosoma a liberar la proteína recién sintetizada. A lo largo de la traducción, varios factores de iniciación eucariotas (eIF), factores de elongación y ARN ribosómicos trabajan juntos para garantizar la precisión y la eficiencia 3,4.
Estudios previos han indicado que las modificaciones postraduccionales desempeñan un papel fundamental en la regulación de las interacciones entre los eIFs y, por lo tanto, influyen en la eficiencia de la traducción. La investigación in vitro ha revelado que la quinasa CASEÍNA quinasa 2 (CK2) fosforila eIF3c, eIF5 y eIF2β para aumentar sus interacciones entre sí y con eIF1 5,6. En la oscuridad, la ligasa E3 CONSTITUTIVAMENTE FOTOMORFOGÉNICA 1 (COP1) reprime la traducción mediante la inhibición de la fosforilación mediada por TOR de S6K-RPS6. El RPS6 no fosforilado es incapaz de formar ribosomas funcionales, deteniendo así la traducción7. Por el contrario, en condiciones de luz, la quinasa SUPPRESSOR OF PHYA 105 (SPA1) fosforila eIF2α para facilitar el ensamblaje del complejo eIF2 y promover el inicio de la traducción8. Estos hallazgos ponen de manifiesto los complejos mecanismos de control que regulan la traducción en respuesta a las señales ambientales.
Los estímulos ambientales moderados pueden promover eficazmente procesos traslacionales para facilitar el crecimiento, como la fotomorfogénesis 8,9. Sin embargo, cuando los factores ambientales son excesivos, las plantas inmóviles necesitan desarrollar mecanismos regulatorios adecuados para mitigar los daños causados por el estrés ambiental10. En estudios previos relacionados con las respuestas al estrés de las plantas, la mayoría se centró en la regulación a nivel metabólico, hormonal y transcripcional 11,12,13,14. Sin embargo, investigaciones recientes han comenzado a destacar la influencia de la regulación traslacional en la tolerancia al estrés de las plantas 15,16,17. Las plantas pueden aumentar su tolerancia al estrés reduciendo la eficiencia de traslación, minimizando así el consumo innecesario de energía. Debido a la formación de gránulos de estrés no membranosos en las células vegetales, el ARNm no traducido y las proteínas asociadas se agregan dentro de ellos para reducir la eficiencia traduccional18. Uno de los estreses ambientales comunes que las plantas encuentran a menudo es el estrés por calor, que se ha reportado que induce la formación de gránulos de estrés dentro de las células vegetales19,20. El aumento global de las temperaturas medias debido al calentamiento global afecta gravemente el rendimiento de los cultivos21. Por lo tanto, el estudio de la regulación fisiológica de las plantas bajo estrés térmico es crucial. Un estudio anterior ha demostrado que el tratamiento térmico del trigo dio lugar a una disminución del ARNm unido a polisomas. Sin embargo, los ARNm almacenados en gránulos de estrés se liberaron y se volvieron a unir a los ribosomas, lo que facilitó la traducción después de la recuperación22. Además, investigaciones anteriores han comparado la expresión génica entre el ARNm total y el ARNm unido a polisomas en plantas sumergidas16. Los resultados indicaron que los niveles de ARNm en estado estacionario asociados con el ácido abscísico y las respuestas de estrés abiótico aumentaron ligeramente después de la inmersión. Además, la cantidad de ARNm unidos a polisomas aumentó significativamente. Estos resultados sugieren que la regulación de la traslación podría desempeñar un papel más crítico en el control de la tolerancia al estrés en las plantas. Por lo tanto, un método eficaz de aislamiento de ARN polisomal es crucial para estudiar el translatomo de muestras tratadas bajo estrés.
En este protocolo, modificamos el método de aislamiento de ARN de la extracción de fenol/cloroformo voluminoso y de alto riesgo con el método de precipitación de LiCl al método de extracción de fenol/tiocianato de guanidinato a pequeña escala, que requiere menos volumen. El primer método consiste en la mezcla directa con fracciones polisomales, lo que resulta en un residuo experimental de mayor tamaño 9,15,23. Por el contrario, este enfoque modificado utiliza principios de densidad diferencial: el ARN polisomal se mezcla primero con una solución sin azúcar con alto contenido de sal y luego se precipita por ultracentrifugación. Posteriormente, la extracción del ARN se realiza utilizando un pequeño volumen de reactivo de tiocianato de fenol/guanidinio. Este método reduce eficazmente la generación de residuos orgánicos, lo que hace que nuestro experimento sea más respetuoso con el medio ambiente. Además, los disolventes orgánicos utilizados tienen una menor toxicidad. Estas razones nos llevaron a ajustar y mejorar los procedimientos experimentales en consecuencia. Además, los métodos anteriores no proporcionaban un protocolo completo para calcular la eficiencia de la traducción mediante la normalización de picos de entrada, que es esencial para análisis translatómicos más profundos.
Aquí, describimos el perfil de polisomas y el protocolo de aislamiento de ARN polisomal para investigar la eficiencia de la traducción y los análisis translatómicos en Arabidopsis bajo estrés de choque térmico. Este protocolo se empleó para evaluar la eficiencia de la traslación en el tipo salvaje Col-0 en condiciones normales, de choque térmico y posteriores a la recuperación. Los resultados del perfil de polisomas y el porcentaje de ARN polisomal revelaron alteraciones en la eficiencia de traducción después del tratamiento de estrés térmico en plántulas de Arabidopsis .
Este protocolo describe un método sencillo y estandarizado para medir la eficiencia de traducción de las plántulas de Arabidopsis. Los pasos críticos de este protocolo son garantizar la estabilidad del ARN con centrifugación secundaria y extracción de ARN, extracción con reactivos, así como una preparación meticulosa del gradiente de sacarosa. Además, proporcionamos pasos críticos para normalizar y cuantificar el ARN polisomal y no polisomal con el método de normalización de…
The authors have nothing to disclose.
Reconocemos los servicios de investigación técnica de ultracentrífugas de Technology Commons en la Facultad de Ciencias de la Vida y el Centro de Instrumentación patrocinado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de la Universidad Nacional de Taiwán (Taiwán). También agradecemos a Yu-Ling Liang por el apoyo técnico y a los miembros del laboratorio Cheng por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Young Scholar Fellowship Fellowship Program del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Taiwán bajo la subvención No. NSTC 113-2636-B-002-007 a M.-C.C. M.-C.C. agradece el apoyo financiero de la Universidad Nacional de Taiwán.
1.5 mL eppendorf tube | Labcon | 3012-870-000-9 | RNA extraction |
13.2 mL centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | ultracentrifugation |
Bromophenol blue | Honeywell | 32712 | Polysome profile |
Chloroform | Honeywell | 32211 | RNA extraction |
Cycloheximide (CHX) | Sigma-Aldrich | SI-C7698 | Polysome profile |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | RNA extraction |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221 | RNA extraction |
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit | Invitrogen | 900433 | Normalization |
Glycerol | Honeywell | 15523 | Normalization |
Heparin | Sigma-Aldrich | SI-H3149 | Polysome profile |
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit | Vazyme | R323-01 | Normalization |
KCl | J.T.Baker | 3040-01 | Polysome profile |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | SI-M8266 | Polysome profile |
MS basal medium | Phyto | M524 | Plant culture |
Peak Chart Syringe Pump | Brandel | SYN4007LS | Polysome profile |
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE) | Sigma-Aldrich | P2393 | Polysome profile |
RNasin | Promega | N251B | Polysome profile |
Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | SI-D6750 | Polysome profile |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S5391 | Polysome profile |
SYBR Green Supermix | Bio-Rad | BP170-8882 | Normalization |
TRI reagent | MRC | TR118 | RNA extraction |
Tris-HCl | J.T.Baker | 4109-06 | Polysome profile |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100K | ultracentrifugation |
UV/VISDETECTOR | Brandel | UA-6 | Polysome profile |