El protocolo describe el mejoramiento de variedades de arroz con almidón resistentes por diseño utilizando tecnologías de edición genómica de una manera precisa, eficiente y técnicamente simple.
Los enfoques convencionales del mejoramiento de cultivos, que se basan predominantemente en métodos que requieren mucho tiempo y mano de obra, como la hibridación tradicional y el mejoramiento por mutación, enfrentan desafíos para introducir de manera eficiente rasgos específicos y generar poblaciones de plantas diversas. Por el contrario, la aparición de las tecnologías de edición del genoma ha marcado el comienzo de un cambio de paradigma, permitiendo la manipulación precisa y acelerada de los genomas de las plantas para introducir intencionadamente las características deseadas. Una de las herramientas de edición más extendidas es el sistema CRISPR/Cas, que ha sido utilizado por los investigadores para estudiar importantes problemas relacionados con la biología. Sin embargo, el flujo de trabajo preciso y eficaz de la edición del genoma no ha sido bien definido en el mejoramiento de cultivos. En este estudio, demostramos todo el proceso de mejora de variedades de arroz enriquecidas con altos niveles de almidón resistente (RS), un rasgo funcional que juega un papel crucial en la prevención de enfermedades como la diabetes y la obesidad. El flujo de trabajo abarcó varios pasos clave, como la selección del gen SBEIIb funcional, el diseño del ARN de guía única (sgRNA), la selección de un vector de edición del genoma adecuado, la determinación del método de administración del vector, la realización del cultivo de tejidos vegetales, la mutación del genotipado y el análisis fenotípico. Además, se ha demostrado claramente el marco temporal necesario para cada etapa del proceso. Este protocolo no solo agiliza el proceso de mejoramiento, sino que también mejora la precisión y la eficiencia de la introducción de rasgos, acelerando así el desarrollo de variedades de arroz funcionales.
El mejoramiento tradicional se basa en la introducción de rasgos en los cultivos o en la producción de poblaciones de plantas con suficiente variación, lo que requiere una observación de campo a largo plazo 1,2. Debido a las limitaciones de la cría tradicional, se ha desarrollado la tecnología de edición genética, que puede modificar con precisión el genoma de los cultivos para obtener los rasgos deseados de las poblaciones de plantas3. El sistema de edición de genes más utilizado en las plantas es CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonuclease), que se basa en una endonucleasa guiada por ARN programable para crear roturas de doble cadena (DSB) dirigidas en el ADN 4,5. Estos DSB son reparados por los mecanismos naturales de reparación del ADN de la célula 6,7, lo que a menudo resulta en la introducción de los cambios genéticos deseados. Aunque esta tecnología se ha implementado en varios cultivos, como el trigo8, el maíz9, la soja10 y el arroz11, se utiliza principalmente para revelar problemas biológicos. En comparación con su amplia aplicación en la elucidación de las funciones de los genes de las plantas, la investigación sobre la aplicación de tecnologías de edición genética al mejoramiento de cultivos sigue siendo relativamente escasa12.
El proceso de edición genética en los cultivos suele seguir un flujo de trabajo bien definido que abarca varios pasos clave13. El primer paso consiste en identificar el gen específico o la región genética que debe modificarse para lograr el rasgo deseado. En segundo lugar, se diseña una estrategia de edición génica, que implica la selección de un sistema de edición génica adecuado (por ejemplo, CRISPR-Cas9 o CRISPR-Cas12) y el diseño de ARN guía específicos para dirigir la endonucleasa al sitio objetivo. En tercer lugar, el sistema de edición de genes se incorpora a un vector de entrega, que se utiliza para introducir la maquinaria de edición en las células vegetales. Estos vectores pueden ser complejos de ADN, ARN o ribonucleoproteínas (RNP). Posteriormente, los vectores de edición génica se introducen en las células vegetales mediante diversos métodos, como la transformación mediada por Agrobacterium, el bombardeo de partículas o la electroporación. Inmediatamente, las células vegetales transformadas se cultivan en condiciones adecuadas para generar callos o tejidos embriogénicos editados genéticamente. Estos tejidos se regeneran en plantas enteras mediante técnicas de cultivo de tejidos. Las plantas regeneradas se someten a una rigurosa caracterización molecular para confirmar la presencia de los cambios genéticos deseados.
Un artículo previo de Tsakirpaloglou et al.14 proporciona una visión general del proceso de edición genética, desde el diseño del vector hasta la generación de plántulas editadas, pero no profundiza en el análisis detallado de los rasgos específicos asociados con el gen objetivo ni en la posterior evaluación del rendimiento agronómico o la validación funcional de los cultivos editados. Hemos ido más allá de simplemente demostrar la factibilidad de editar un gen en el arroz. Nuestro trabajo evalúa exhaustivamente el impacto de esta edición en las características bioquímicas, moleculares y agronómicas de las líneas de arroz editadas. Esto incluye la evaluación de la composición del almidón, un factor crítico que influye en la calidad del grano y el valor nutricional, que no se ha explorado ampliamente en estudios previos de edición genética.
El almidón de arroz generalmente consta de ~ 20% de amilosa y ~ 80% de amilopectina15. SBEIIb es una enzima esencial para la síntesis de amilopectina y se expresa en el endospermo16. La eliminación de OsSBEIIb por la expresión de ARN de horquilla (ARNi) y microARN aumentó el contenido de almidón resistente17,18. El almidón resistente es un almidón de sustrato que no puede ser digerido y absorbido en el intestino delgado, pero que puede ser descompuesto en ácidos grasos de cadena corta y gases por ciertas bacterias digestivas en los intestinos. Dado que no se puede descomponer rápidamente, tiene un índice glucémico más bajo en comparación con otros almidones y no causa un aumento rápido del azúcar en la sangre en un corto período de tiempo después de comer, lo que puede aliviar la diabetes hasta cierto punto en la dieta19. Además, el almidón resistente tiene funciones más fisiológicas, como reducir la respuesta a la insulina, regular la función intestinal, prevenir la acumulación de grasa, facilitar el control de peso y promover la absorción de iones minerales. Por lo tanto, está siendo ampliamente buscado como un nuevo tipo de fibra dietética20.
Para superar estos desafíos y utilizar con éxito las tecnologías de edición de genes para el mejoramiento de variedades funcionales de arroz, hemos refinado y optimizado los protocolos operativos dentro del arroz. Nuestro objetivo ha sido analizar meticulosamente el diseño de los loci de genes diana, seleccionar cuidadosamente las herramientas de edición de genes más adecuadas y realizar un riguroso análisis fenotípico durante todo el proceso de mejora. Como testimonio del poder y la eficiencia de estas tecnologías, presentamos un estudio de caso que muestra el rápido desarrollo de una variedad de arroz funcional enriquecida con almidón de alta resistencia. Este ejemplo subraya el potencial de la edición genética para acelerar el mejoramiento de arroz funcional, abordando la escasez actual de investigación en este campo.
En el proceso de construcción de vectores knockdown basados en CRISPR/Cas-SF01, la selección meticulosa de ARN de guía única (sgRNA) es fundamental. Esto requiere la adopción de secuencias que exhiban una alta eficiencia de edición con efectos mínimos fuera del objetivo. Además, la síntesis de cebadores dirigidos incorpora oligonucleótidos adaptadores cortos que coinciden con los sitios de empalme del vector, lo que garantiza una integración perfecta. En particular, a diferenc…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo contó con el apoyo financiero de los Proyectos Principales de Mejoramiento Biológico (2023ZD04074).
2 x Taq Plus Master Mix II | Vazyme Biotech Co.,Ltd | P213 | Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes |
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio | Phyto Technology | D309 | |
AAM medium | Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd | M9051C | |
BsaI-HF | New england biolabs | R3535 | Bsa I enzyme digestion of the editing vector |
Carbenicillin antibiotics | Applygen | APC8250-5 | Selection medium, regeneration medium |
Casaminoacid | BBI-Life SciencesCorporation | A603060-0500 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
DH5α Chemically Competent Cell | Weidi Biotechnology Co., Ltd. | DL1001 | E. coli competent cells |
D-Sorbitol | BBI-Life SciencesCorporation | A610491-0500 | |
EDTA,disodium salt,dihydrate | Diamond | A100105-0500 | CTAB buffer |
EHA105 Chemically Competent Cell | Weidi Biotechnology Co., Ltd. | AC1010 | Agrobacterium competent cells |
FastPure Plasmid Mini Kit | Vazyme Biotech Co.,Ltd | REC01-100 | Plasmid isolated |
Hygromycin antibiotics | Yeasen | 60224ES | co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium |
Kanamycin antibiotics | Yeasen | 60206ES10 | Selection agrobacterium |
KOH | Macklin | P766798 | CTAB buffer |
L-Glutamine | Phyto Technology | G229 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
L-Proline | Phyto Technology | P698 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
Mautre dry rice seeds (Xiushui134) | – | – | Japonica varieties for breeding RS rice |
Mill rice mechine | MARUMASU | MHR1500A | To produce white rice |
Murashige Skoog | Phyto Technology | M519 | Root medium, regeneration medium |
Myo-inositol | Phyto Technology | I703 | Regeneration medium |
NaCl | Macklin | S805275 | For YEP media |
NB Basal Medium | Phyto Technology | N492 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
Peptone | Solarbio | LA8800 | For YEP media |
Phytogel | Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd | S24793 | |
Pot | Midea group Co. | MB-5E86 | For cooking rice |
Refrigerator | Haier | BCD-170 | Storage the medium |
Resistant Starch Assay Kit | Megazyme | K-RSTAR | Measurement and analysis resistant starch |
Rifampicin antibiotics | Sigma | R3501-250MG | Selection agrobacterium |
Sodium hypochlorite solution | Macklin | S817439 | For seed sterilization |
Sucrose | Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd | B21647 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
T4 DNA Ligase | New england biolabs | M0202 | Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector |
The glucose monitor | Medical Equipment & Supply Co., Ltd | Xuetang 582 | Detection the blood glucose |
Tris-HCL | Macklin | T766494 | CTAB buffer |
Yeast Agar | Solarbio | LA1370 | For YEP media |
YEP media | – | – | Cultivation of Agrobacterium |