El cultivo de órganos ex vivo de córnea porcina y la cicatrización de heridas epiteliales proporcionan un medio económico, ético, reproducible y cuantitativo para probar la toxicidad ocular de los productos químicos. También ayudan a dilucidar los mecanismos subyacentes a la regulación de la epitelización y la reparación de tejidos, y a evaluar terapias para el tratamiento de la queratopatía diabética y el retraso en la cicatrización de heridas.
Debido a sus similitudes anatómicas y fisiológicas con el ojo humano, el ojo porcino sirve como un modelo robusto para la investigación biomédica y la evaluación de la toxicidad ocular. Se desarrolló un sistema de cultivo de córnea aire/líquido utilizando ojos porcinos, y la cicatrización de heridas epiteliales ex vivo se utilizó como parámetro crítico para estos estudios. Se procesaron córneas frescas de cerdo para el cultivo de órganos, con o sin lesiones epiteliales. Las córneas se cultivaron en una incubadora humidificada de CO2 al 5% a 37 °C en MEM, con o sin agentes de prueba. Se midió la permeabilidad de la córnea y las tasas de cicatrización de heridas, y las células epiteliales y/o las córneas enteras se pueden procesar para inmunohistoquímica, Western blot y qPCR para análisis moleculares y celulares. En este estudio se describe un protocolo detallado y se presentan dos estudios en los que se utiliza este sistema ex vivo . Los datos muestran que el cultivo de órganos corneales porcinos, combinado con la cicatrización de heridas epiteliales, es un modelo ex vivo adecuado para las pruebas de toxicidad química, el estudio de la queratopatía diabética y la identificación de posibles terapias.
Mientras que los modelos celulares poseen poblaciones clonales limitadas y no logran reproducir la arquitectura in vivo de un organismo, el cultivo o explante de órganos ofrece información sobre la función de los órganos, el desarrollo, los mecanismos de la enfermedad y las posibles terapias, al tiempo que proporciona ventajas éticas y fisiológicas sobre otros modelos experimentales 1,2. Además de reducir el número de animales necesarios, el cultivo de explantes controla y manipula sensiblemente las condiciones circundantes, lo que es ideal para una exploración detallada de los factores que controlan la proliferación celular, la migración, la respuesta a las heridas y la diferenciación celular en un entorno de cultivo de órganos 2,3. Entre los diferentes tejidos/órganos, los explantes corneales, incluido el de los seres humanos 4,5,6, se han utilizado ampliamente para la toxicidad ocular, las evaluaciones de irritación 7,8, para estudiar molecularmente los mecanismos subyacentes a la función de las células madre9 y la cicatrización de heridas10,11, y para el glaucoma primario de ángulo abierto12.
Las córneas porcinas comparten varias similitudes estructurales y fisiológicas con las córneas humanas, lo que las convierte en un excelente modelo para estudiar la biología y las enfermedades de la córnea humana. Estructuralmente, ambos tienen la capa de Bowman, 5-7 capas de células epiteliales y una curvatura y diámetro similares. Fisiológicamente, son altamente transparentes, tienen una composición de película lagrimal e hidratación corneal similares, exhiben patrones y funciones comparables de inervación corneal y siguen procesos de cicatrización de heridas similares, lo que los convierte en un excelente modelo para estudiar la biología y las enfermedades de la córnea humana13,14. Si bien las córneas humanas y porcinas tienen ligeras diferencias en la disposición de las fibrillas de colágeno y el contenido de agua, sus señales y respuestas inmunitarias no son idénticas. Estas diferencias plantean desafíos para el xenotrasplante15. Por lo tanto, las diferencias específicas de las especies deben tenerse en cuenta al interpretar los datos experimentales.
En comparación con las córneas humanas, los ojos porcinos están fácilmente disponibles como subproductos de la industria cárnica, lo que los hace rentables y fácilmente accesibles para la investigación14. El uso de córneas porcinas ayuda a reducir la necesidad de córneas de donantes humanos y minimiza las preocupaciones éticas asociadas con las pruebas con animales. Además, la disponibilidad de muchas córneas porcinas a la vez permite realizar experimentos consistentes y reproducibles, lo cual es crucial para obtener resultados de investigación confiables.
Inicialmente se utilizó un sistema de cultivo de órganos corneales porcinos para reemplazar las pruebas en animales de productos químicos cosméticos y medicamentos oculares7. Este sistema se ha utilizado para estudiar la cicatrización de heridas epiteliales corneales y para identificar varias vías de señalización importantes, como el desprendimiento del ectodominio HB-EGF, la estimulación del ácido lisofosfatídico mediador lipídico y la activación de EGFR para la cicatrización de heridas corneales16,17. Utilizando la glucosa alta como factor patológico, se estableció un modelo ex vivo de hiperglucemia con retraso en la cicatrización de heridas epiteliales para imitar la queratopatía diabética humana. Utilizando este modelo, se demostró que las expresiones de equilibrio de IL-1β frente a IL-1Ra18 y TGFβ3 frente a TGFβ119 son factores importantes para la cicatrización adecuada de las heridas en las córneas, y la manipulación de estos equilibrios puede utilizarse para tratar la queratopatía diabética. Por lo tanto, el cultivo de órganos porcinos representa un sistema de experimentación relevante, económico y manipulador con diversas aplicaciones en pruebas de toxicidad química, investigación biomédica, descubrimiento de fármacos y evaluación del daño y la reparación de tejidos en respuesta a la exposición ocular a armas químicas.
En este artículo, se describe un protocolo detallado de cultivo de órganos corneales porcinos, y se ilustran sus aplicaciones para evaluar los efectos potenciales de las gotas oftálmicas de AINE (NS) oculares en la salud de la córnea y para determinar las vías de señalización y los procesos biológicos implicados en la patogénesis de la queratopatía diabética.
Se han utilizado córneas bovinas cultivadas y mayoritariamente porcinas para evaluar la toxicidad de productos químicos cosméticos, medicamentos para el glaucoma y antiinflamatorios no esteroideos21,26. Las córneas de cerdo también se han utilizado como modelo ex vivo de la queratopatía diabética humana. A diferencia de los ojos de conejo, el ojo de cerdo se asemeja al ojo humano anatómica, fisi…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a los Dres. Keping Xu (M.D. y O.D.) y Jia Yin (M.D. y Ph.D.) por sus contribuciones al desarrollo del cultivo de órganos corneales bovinos y porcinos y a Ray Guo y Andy Wu de Troy High School por las ilustraciones de la Figura 1. La investigación de laboratorio del Dr. Yu fue financiada por subvenciones de los NIH (R01 EY010869, R01EY035785, P30 EY04068) y por Investigación para Prevenir la Ceguera en el Instituto Oftalmológico Kresge.
1.7 mL tubes | Axygen | AXYMCT175SP | |
Agarose | Thermo Scientific | R0491 | |
Bromfenac (Prolensa) 0.09% | |||
Camera | Canon | PowerShot A620 | |
Cell Culture Dish | Corning | 430165 | |
D-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000c | |
Forceps | FisherScientific | 10-316A | |
Hemostat | FisherScientific | 13-812-14 | |
Ketorolac (Acular) 0.45% | Kresge Clinic | ||
Kimwipes | Kimtech | 34155 | |
LL-37 | Tocris | 5213/1 | |
Minimum essential medium (MEM) | Gibco | A1048901 | |
Nepafenac (Ilevro) 0.1% | |||
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Phosphate buffered saline | Sigma | P4417 | |
Pig eyes | Bernthal Packing Inc. | ||
Pipet tips | VWR | 76322-164 | |
Porcine corneas | Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI | ||
Povidone-Iodine | Betadine | ||
Q-Tips cotton swabs | Q-Tips | ||
Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72002-01 | |
Razor blade holder | Stotz | ||
Scalpel | Bard-Parker | 377112 | |
Scalpel Handle | Bard-Parker | #3 | |
Scissors | FisherScientific | 08-951-20 | |
Silicon mold | |||
Tissue culter enclosure | Labconco | 5100000 | |
Trephine | Acu.Punch | 3813775 | |
Water bath | VWR | 1235 |