Medición de cuatro subtipos de células NK uterinas mediante tinción inmunohistoquímica fluorescente multiplexada en mujeres con fallo de implantación repetido

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Clínica del Clúster Este de la Universidad China Conjunta de Hong Kong-Nuevos Territorios (CREC ref no.: 2022.581). Las mujeres con RIF fueron reclutadas en el Centro de Tecnología de Reproducción Asistida del Hospital Príncipe de Gales de la Universidad China de Hong Kong. El RIF se definió como la imposibilidad de lograr un embarazo clínico después de la transferencia de al menos 4 embriones de buena calidad en un mínimo de 3 ciclos frescos o congelados en una mujer menor de 40 años10. Se obtuvo el consentimiento informado de las participantes antes de tomar las biopsias endometriales. 1. Adquisición y procesamiento de muestras endometriales Momento de la recolección de la muestra endometrialRecolectar muestras de endometrio siguiendo un protocolo estricto para garantizar la consistencia entre las participantes del estudio. Para pacientes con ciclos naturales, realizar análisis de orina a partir del9º día del ciclo menstrual y realizar biopsia endometrial el7º día después del aumento de LH (LH+7)11 . Para las pacientes que se someten a ciclos de terapia de reemplazo hormonal (TRH), administre 6 mg de valerato de estradiol por vía oral diariamente a partir del día 2 del ciclo menstrual. Evaluar el grosor del endometrio mediante ecografía el día 13 del ciclo menstrual. Cuando el grosor del endometrio alcanza o supera los 8 mm, administrar progesterona por vía transvaginal y realizar una biopsia endometrial 5 días después de la administración de progesterona12. Recogida y fijación de muestras endometriales: introducir un muestreador de pipetas en la cavidad uterina, avanzando hasta la región uterina; Aplique la succión tirando hacia abajo del émbolo interno, raspando simultáneamente la superficie endometrial a través de movimientos rotacionales y verticales dentro de la cavidad uterina. Enjuague las muestras recolectadas con solución salina normal para eliminar las secreciones cervicales y uterinas. Mida las muestras y evalúe el tamaño. Para muestras de 3 mm x 15-25 mm, sumergirlas inmediatamente en 10 mL de formalina tamponada neutra al 10% y fijarlas a temperatura ambiente durante 24-48 h. Deshidratación: Una vez finalizada la fijación, se someten las muestras a una secuencia de deshidratación diseñada para reemplazar el agua con etanol. Para ello, sumerja los pañuelos en baños de etanol al 70%, 80%, 90% y 100% para garantizar una deshidratación completa. Después del baño final de etanol, limpie las muestras en xileno para eliminar cualquier residuo de alcohol y prepárelas para la infiltración de parafina. Incrustación: Después de colocar el tejido plano en el fondo del molde, derrita la parafina y agréguela con cuidado a las muestras para asegurarse de que el tejido endometrial esté completamente encapsulado en la matriz de parafina. Después de llenar los moldes con cera de parafina, enfríelos en una mesa de congelación para promover la solidificación de la cera de parafina. Una vez que los bloques de parafina se endurezcan, almacene a temperatura ambiente hasta que se requiera un procesamiento adicional.NOTA: Los moldes utilizados se eligieron específicamente para acomodar el tamaño de las muestras endometriales obtenidas para permitir que el tejido endometrial quede plano en el fondo sin doblarse, asegurando así una orientación óptima para el corte posterior y sin crear excesos innecesarios. Seccionado: Para preparar el corte, refrigere los bloques de parafina a 4 °C durante 2 h. Cortar las muestras en secciones de 4 μm con un micrótomo, luego aplanar las rodajas en la superficie de agua destilada calentada a 42 °C y montarlas en portaobjetos de vidrio adhesivo. Coloque las rodajas en una secadora deslizante durante la noche y guárdelas a temperatura ambiente antes de usarlas. 2. Optimización de las condiciones de inmunohistoquímica múltiple Validación de IHQ: Para la validación de los parámetros de tinción de IHQ, adopte un enfoque sistemático para ajustar las condiciones de recuperación de antígenos, concentración de anticuerpos y tiempos de incubación.Dentro de los rangos de dilución recomendados por el fabricante, pruebe 2-3 concentraciones para cada anticuerpo. Optimice la recuperación de antígenos comparando tampones a pH 6 y pH 9, y evalúe los protocolos de incubación tanto a temperatura ambiente durante 1,5 h como durante la noche a 4 °C. Evalúe cada condición meticulosamente, centrándose en la intensidad de la tinción, la especificidad y el ruido de fondo. Seleccione la combinación óptima que produzca la tinción más clara y específica con una unión inespecífica mínima. Esta rigurosa validación garantizó la máxima precisión y reproducibilidad en el protocolo IHC. Tinción monoplex de amplificación de señal de tiramida (TSA): después de determinar los parámetros de tinción óptimos para anticuerpos individuales, optimice el emparejamiento de anticuerpos con diferentes colorantes TSA. Empareje el marcador con mayor expresión con un colorante con un nivel de intensidad de fluorescencia más bajo, o viceversa. Durante esta fase, realice ajustes en la concentración de anticuerpos y el tiempo de incubación de acuerdo con la intensidad de la señal de fluorescencia observada. Si se observa una tinción de fondo significativa o inespecífica, cambie el tinte emparejado13. Tinción múltiple TSA: Para el protocolo de inmunohistoquímica múltiple (m-IHC), el orden secuencial de la tinción se ha definido cuidadosamente de acuerdo con los principios establecidos. Para garantizar que el proceso de multiplexación refleje la sensibilidad y la especificidad de la tinción de una sola marca, se priorizaron los anticuerpos con niveles de expresión más bajos al comienzo de la secuencia de tinción. Coloque los anticuerpos que requieren reparación de bases para la recuperación de antígenos al final de la secuencia de tinción, ya que la reparación de bases es robusta en comparación con los métodos basados en ácidos, que pueden, en algunos casos, amplificar artefactos de tinción inespecíficos. Utilizando los hallazgos de los pasos 2.1 y 2.2, decida qué anticuerpos se usarán y en qué etapa, en función de sus requisitos de recuperación de antígenos y densidades de expresión. Por ejemplo, el anticuerpo CXCR4, que requiere una reparación de base para la recuperación de antígenos, se ha colocado en las etapas finales de la tinción. Por el contrario, el anticuerpo CD49a, que se caracteriza por una menor densidad de expresión, ha obtenido la primera posición en la secuencia de tinción. Maximice las posibilidades de una detección exitosa y minimice los efectos de enmascaramiento que puedan producirse en las últimas etapas del procedimiento de multiplexación. Para los anticuerpos restantes, pruebe diferentes combinaciones durante la fase de optimización para determinar la secuencia más efectiva que equilibre la sensibilidad y la especificidad. Los resultados de estos análisis comparativos guiarán la composición final del panel multiplex, como se detalla en la Tabla 1, asegurando que el panel seleccionado proporcione un rendimiento óptimo al tiempo que minimiza el fondo. 3. Proceso m-IHC Desparafinado, hidratación y fijación: Hornee las secciones de tejido a 60 °C durante 2 h, seguido de inmersión secuencial en xileno I (10 min), xileno II (10 min), 100% etanol (5 min), 95% etanol (5 min), 80% etanol (5 min), 75% etanol (5 min), ddH2O (2 min para 3x), 10% formalina tamponada neutra (al menos 20 min), y ddH2O (2 min para 3x). Recuperación de antígenos: Agregue 200 mL del respectivo tampón AR6 o AR9, como se indica en la Tabla 1 para cada anticuerpo, a un casete de recuperación de antígeno resistente al calor. Coloque las secciones en el tampón de recuperación de antígeno adecuado y caliente en un microondas a alta potencia durante unos 2 minutos hasta que hierva. Posteriormente, cubra el casete sin apretar, caliéntelo a baja potencia durante 15 minutos y enfríe a temperatura ambiente. Enjuague las secciones con ddH2O y PBST. Dibujo de la barrera hidrofóbica: Después de eliminar el exceso de solución con papel absorbente, dibuje un círculo completo alrededor del tejido con un rotulador de barrera hidrofóbica. Inactivación de la actividad enzimática endógena: Tratar las secciones con peróxido de hidrógeno al 3% e incubar durante 8 min a temperatura ambiente. Lavar con PBST 3 veces durante 2 minutos cada uno. Bloqueo de sitios inespecíficos: Después de secar con papel absorbente, aplicar una solución de bloqueo (1x Antibody Diluyente/Block) e incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Incubación con anticuerpo primario: Después de retirar la solución de bloqueo, aplique 150 μL del primer anticuerpo primario, CD49a, en cada portaobjetos a una dilución de 1:1000 en 1x Diluyente de anticuerpos. Incubar como se ha optimizado previamente en la sección 2. Después de la incubación, lave los portaobjetos con PBST 3x durante 2 minutos cada uno. Para los anticuerpos restantes, consulte la Tabla 1 para conocer las proporciones de dilución específicas. Incubación con anticuerpo secundario: Antes de aplicar el anticuerpo secundario, utilice papel absorbente para eliminar el exceso de humedad y evitar la dilución del reactivo. Añadir 4-5 gotas (aproximadamente 150 μL) del anticuerpo secundario 1x Anti-Ms + Rb HRP en cada portaobjetos, seguido de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente. Realice tres lavados con PBST durante 2 minutos cada post-incubación.NOTA: Tenga en cuenta que el anticuerpo secundario 1x Anti-Ms + Rb HRP es específico para anticuerpos primarios de conejo y ratón. Amplificación de la señal con colorante TSA: Después de secar el exceso de humedad, diluya el colorante TSA 1:100 en el diluyente de amplificación. Agregue 150 μL de esta solución de colorante TSA diluida a cada portaobjetos. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Lavar con PBST 3 veces durante 2 minutos cada uno. Repita los pasos 3.2 y 3.5-3.8 para el procedimiento TSA utilizando el anticuerpo y el colorante correspondientes. Núcleos de tinción: Después de teñir el último anticuerpo, elimine los fluoróforos no unidos calentando en el microondas secciones en 200 ml de tampón AR6 dentro de un casete resistente al calor, hirviendo durante 2 minutos, luego calentando a baja potencia durante 15 minutos. Enfríe las muestras a temperatura ambiente y enjuague con ddH2O y PBST. Añadir 150 μL de solución de trabajo DAPI diluida en PBST (1:10) gota a gota, incubar durante 10 min a temperatura ambiente y enjuagar 2 veces con ddH2O. Montaje: Una vez que las secciones se hayan secado completamente al aire en un área oscura durante aproximadamente 30 minutos, aplique una sola gota (alrededor de 30 μL) del soporte fluorescente anti-enfriamiento y coloque cubreobjetos.NOTA: Proteja todas las operaciones de la luz después de la primera aplicación del tinte TSA. La observación rápida y la captura de imágenes fueron esenciales después de la finalización de la tinción para evitar el enfriamiento de la fluorescencia. 4. Adquisición y análisis de imágenes Tiempo de exposición: Capture imágenes utilizando un generador de imágenes que hereda las longitudes de onda de excitación y emisión correspondientes a los fluoróforos. Al ajustar los tiempos de exposición, compruebe las diapositivas con una amplia gama de expresiones de marcador para garantizar la precisión. Para cada combinación de marcador/filtro, concéntrese manualmente en diferentes áreas de la diapositiva. Utilice la función Exposición automática para establecer el tiempo de exposición. Seleccione los filtros de acuerdo con los tintes de la TSA y examine varios portaobjetos para determinar los tiempos de exposición óptimos por canal. Aplique estos ajustes de forma coherente a todas las adquisiciones posteriores para mantener la comparabilidad a lo largo de las imágenes. Selección de las áreas de captura: Para garantizar un muestreo imparcial en todas las secciones de tejido y una inclusión coherente del epitelio luminal en cada campo analizado, seleccione aleatoriamente el área inicial para la adquisición de imágenes, siendo el criterio crítico la presencia del borde epitelial luminal. Después de la captura de este campo inicial, seleccione sistemáticamente las áreas posteriores moviendo un campo a la izquierda o a la derecha del punto de inicio (omitiendo un campo entre cada imagen capturada) mientras mantiene el borde epitelial luminal dentro del marco. Repita este proceso para capturar al menos cinco áreas diferentes, cada una de las cuales contiene al menos una porción del epitelio luminal, para mantener una profundidad de análisis constante a lo largo de14. Este enfoque tenía como objetivo incluir un mínimo de aproximadamente 10.000 células estromales en todos los campos capturados para garantizar una recopilación de datos completa y representativa. Análisis de imágenesPreparación de la imagen: Para importar y analizar imágenes multiespectrales, primero vaya a Archivo > Abrir imagen en la interfaz del software para cargar los archivos y la diapositiva de autofluorescencia (AF). Después de cargar las imágenes, proceda a desmezclar los fluoróforos haciendo clic en el botón Seleccionar fluores y seleccionando la biblioteca espectral adecuada. Una vez que se hayan seleccionado todos los fluoróforos, haga clic en Aceptar para confirmar la selección. Para aislar el espectro AF, utilice la herramienta cuentagotas AF para muestrear un área representativa de tejido de la imagen AF, teniendo cuidado de excluir cualquier píxel que no sea de tejido. Después de muestrear, haga clic en Preparar imagen o Preparar todo en la esquina inferior izquierda de la interfaz15. Segmentación de tejidos: Inicie el proceso de segmentación delineando manualmente una línea de base de 3 a 5 regiones por tipo de tejido dentro de la imagen, incluidas las áreas epiteliales que contienen células epiteliales, las áreas estromales que contienen células estromales y las áreas en blanco sin contenido celular. Si los resultados de la segmentación inicial no son satisfactorios, anote manualmente regiones adicionales para mejorar el conjunto de datos de entrenamiento, aumentando así la precisión y la fiabilidad de los análisis posteriores. Este ajuste dinámico de regiones y parámetros garantiza que el software pueda identificar automáticamente estructuras similares en la imagen actual y otras imágenes importadas con mayor precisión.NOTA: La anotación inicial sirve como un conjunto de datos de entrenamiento para que el software aprenda las características de cada componente del tejido. Las capacidades de segmentación del software se refinan de forma iterativa en función de la complejidad y la variabilidad del tejido. Segmentación de celdas: Haga clic en Segmentar celdas para iniciar la segmentación de celdas. En la Configuración de segmentación de celdas, seleccione Núcleos y membrana. Elija DAPI para identificar los núcleos celulares y ajustar la configuración de intensidad para detectar todos los núcleos celulares sin ruido de fondo. Seleccione las señales CD16, CD49a y CD56 para encontrar la membrana y utilizar esta señal para ayudar en la división nuclear. Utilice la función de división de componentes nucleares para distinguir núcleos ubicados muy cerca.NOTA: DAPI resalta el interior de las celdas. La función de división de componentes nucleares ayuda a distinguir los núcleos celulares cuando están muy juntos o parecen fusionados. Este paso es importante para obtener recuentos de células fiables y mantener la integridad del análisis. Fenotipado celular: Adopte cuatro marcadores de superficie celular diferentes, incluidos CD56, CD49a, CXCR4 y CD16 para diferenciar diferentes subtipos de células NK. En el esquema de fenotipado, etiquete estos cuatro marcadores como los fenotipos a continuar. En la sección Vista de asociado, asigne colores específicos a cada uno de los fenotipos para su identificación. Con el botón Agregar, clasifique las celdas como que expresan positiva o negativamente los marcadores; por ejemplo, en el fenotipo CD56, las células se pueden etiquetar como CD56+ o CD56-. Etiquete manualmente al menos cinco celdas para cada fenotipo durante el proceso de entrenamiento. Realice un etiquetado manual adicional si la capacitación inicial no produce resultados efectivos. Una vez establecida la configuración del fenotipado celular, cada celda de la imagen indicará si los cuatro marcadores de superficie se expresan positiva o negativamente. Exporte los datos resultantes a una hoja de cálculo para su posterior análisis. Procesamiento de datos: Importe los datos obtenidos de todas las imágenes en una hoja de cálculo para su procesamiento. Calcule porcentajes de todos los subtipos de celdas uNK en relación con el número total de celdas de la imagen. El recuento final de células representa el recuento promedio en varias imágenes, lo que proporciona una descripción general completa de la población de varios subtipos de células uNK dentro de la muestra.