El protocolo propuesto implica un enfoque global para evaluar la formación ósea en el contexto de la regeneración ósea mediante análisis multimodales. Su objetivo es proporcionar información cualitativa y cuantitativa sobre la formación de hueso nuevo, mejorando el rigor y la validez de las investigaciones básicas y preclínicas.
La caracterización extensiva de la mineralización tisular en el contexto de la regeneración ósea representa un desafío importante, dadas las numerosas modalidades que actualmente están disponibles para el análisis. Aquí, proponemos un flujo de trabajo para una evaluación integral de la formación de hueso nuevo utilizando un explante ex vivo óseo de animal grande relevante. Se crea un defecto óseo (diámetro = 3,75 mm; profundidad = 5,0 mm) en la cabeza femoral de una oveja explantada y se inyecta un sustituto óseo macroporoso cargado con un factor de crecimiento proosteogénico (proteína morfogenética ósea 2 – BMP2). Posteriormente, el explante se mantiene en cultivo durante un periodo de 28 días, permitiendo la colonización celular y la posterior formación de hueso. Para evaluar la calidad y estructura del tejido recién mineralizado, se establecen los siguientes métodos sucesivos: (i) Caracterización e imágenes 3D de alta resolución de todo el explante mediante micro-CT, seguidas de análisis de imágenes de aprendizaje profundo para mejorar la discriminación de los tejidos mineralizados; ii) Nanoindentación para determinar las propiedades mecánicas del tejido recién formado; (iii) Exámenes histológicos, como hematoxilina/eosina/azafrán (HES), tricrómico de Goldner y pentacromo de Movat para proporcionar una evaluación cualitativa del tejido mineralizado, particularmente con respecto a la visualización de la barrera osteoide y la presencia de células óseas; (iv) Mapeo de microscopía electrónica de barrido (SEM) de retrodispersión con referencia interna para cuantificar el grado de mineralización y proporcionar información detallada sobre la morfología de la superficie, la composición mineral y la interfaz hueso-biomaterial; (v) Espectroscopía Raman para caracterizar la composición molecular de la matriz mineralizada y proporcionar información sobre la persistencia de BMP2 dentro del cemento a través de la detección de enlaces peptídicos. Este análisis multimodal proporcionará una evaluación eficaz del hueso recién formado y una visión cualitativa y cuantitativa completa de los tejidos mineralizados. A través de la estandarización de estos protocolos, nuestro objetivo es facilitar las comparaciones entre estudios y mejorar la validez y confiabilidad de los hallazgos de la investigación.
Los defectos óseos, ya sean causados por traumatismos, resección de tumores, anomalías congénitas o infecciones, representan un gran desafío para la medicina regenerativa. Estas alteraciones comprometen la integridad estructural del sistema esquelético, lo que provoca molestias, deterioro funcional y una reducción de la calidad de vida de los pacientes.
Para superar estos desafíos, han surgido estrategias innovadoras de reparación ósea, con un enfoque en mejorar la osteogénesis y la regeneración del tejido óseo. Estos enfoques incluyen el uso de sustitutos óseos implantables, inyectables o imprimibles en 3D, que pueden ser de origen natural (p. ej., macromoléculas de origen biológico, hidroxiapatita de origen animal) o sintéticos (p. ej., biovidrios, fosfatos de calcio)1. Para mejorar su baja capacidad inherente para guiar y estimular la regeneración ósea, los sustitutos óseos pueden cargarse con factores osteoinductores, como las proteínas morfogenéticas óseas (BMP), para promover la diferenciación osteogénica de las células progenitoras y mejorar la formación ósea2.
La formación ósea se basa en la formación inicial de una matriz de colágeno, que luego es mineralizada por cristales de hidroxiapatita, reforzando así la estructura ósea3. Este proceso confiere rigidez y resistencia específicas al hueso. La calidad del tejido mineralizado está estrechamente gobernada por sus atributos microestructurales y su grado de mineralización4. Esta cualidad desempeña un papel fundamental en la cicatrización ósea y en la funcionalidad del hueso regenerado5. Sin embargo, la caracterización de la mineralización ósea sigue siendo una tarea desafiante debido a la variabilidad inherente entre los estudios multivariados 6,7,8.
Además, las evaluaciones iniciales de la biocompatibilidad, la citocompatibilidad y el potencial de diferenciación de los sustitutos de injertos óseos suelen realizarse in vitro. Sin embargo, las disparidades metodológicas impiden la comparación fluida de los resultados. Además, estos estudios in vitro no capturan completamente las interacciones multicelulares y el diálogo complejo entre las poblaciones celulares, incluidas las células de la médula ósea, que son esenciales para regular el proceso de regeneración ósea9. Esta falta de representación precisa del microambiente óseo puede comprometer la precisión de los estudios preclínicos posteriores10.
Aunque las evaluaciones in vivo proporcionan una representación más precisa de los contextos fisiológicos, están limitadas por consideraciones éticas, logísticas y financieras. En consecuencia, las evaluaciones ex vivo juegan un papel fundamental como interfaz entre los estudios in vitro e in vivo, sirviendo como un paso intermedio necesario antes de pasar a los experimentos en sujetos vivos 11,12,13.
En este contexto, es necesaria la implementación de metodologías de caracterización integrales para evaluar la calidad del tejido óseo regenerado y garantizar la pertinencia de la estrategia antes de pasar a un modelo preclínico. En consecuencia, proponemos un protocolo basado en el análisis de un modelo de explante utilizando tejido articular de rodilla de oveja. Esta metodología innovadora consiste en implantar cemento cargado de BMP2 en los explantes y realizar un análisis detallado de la mineralización del tejido después de 28 días de cultivo.
Los enfoques técnicos empleados en este estudio son diversos y complementarios, proporcionando colectivamente un enfoque integral para evaluar la calidad del tejido óseo regenerado (Figura 1). Las imágenes de micro-TC de alta resolución permiten una visualización detallada en 3D de la estructura ósea, lo que proporciona información valiosa sobre la densidad mineral, la morfología y la integridad del tejido recién formado. Esta técnica es crucial para evaluar la eficacia de la regeneración ósea y monitorear la progresión de la mineralización a lo largo del tiempo. La nanoindentación es un enfoque preciso para determinar las propiedades mecánicas del tejido, como su dureza y resistencia. Al medir la respuesta del material a una fuerza aplicada a escala nanométrica, este método permite evaluar la robustez y la calidad del tejido mineralizado. Los exámenes histológicos que utilizan tinciones comunes como la hematoxilina/eosina/azafrán (HES), el tricrómico de Goldner y el pentacromo de Movat proporcionan información valiosa sobre la estructura y composición de los tejidos. Estas tinciones permiten la diferenciación de los distintos componentes del tejido, incluidas las células, la matriz extracelular y los depósitos minerales, lo que permite una evaluación cualitativa completa del proceso de regeneración ósea. El mapeo de microscopía electrónica de barrido (SEM) de retrodispersión ofrece una visualización de alta resolución de la superficie de las muestras, lo que permite un análisis detallado del grado de mineralización de la matriz ósea, así como de las interfaces entre el material implantado y el tejido huésped. Por último, la espectroscopia Raman proporciona información sobre la composición molecular del tejido, en particular mediante la identificación de componentes específicos como proteínas, lípidos y minerales. Este enfoque permite la caracterización de la matriz mineralizada y la detección de factores de crecimiento como BMP2, proporcionando así información crucial sobre la persistencia de estímulos pro-osteogénicos en el medio de regeneración.
Utilizando un enfoque multidisciplinar, integrando diversas técnicas analíticas, nuestro estudio tiene como objetivo proporcionar una evaluación exhaustiva y completa de la calidad del tejido óseo regenerado, proporcionando así una base sólida para la evaluación de los sustitutos de injertos óseos y su potencial aplicación clínica.
La reparación de los defectos óseos es un desafío importante en la medicina regenerativa para restaurar la movilidad, reducir el dolor y mejorar la calidad de vida de las personas afectadas. El uso de modelos de explantes ofrece una serie de ventajas en comparación con los estudios in vivo para la investigación de la reparación de defectos óseos. Además de las consideraciones éticas, este modelo permite el control riguroso de las condiciones experimentales y la reducci?…
The authors have nothing to disclose.
Queremos agradecer a las instalaciones técnicas involucradas en la recolección y procesamiento de especímenes, incluyendo SC3M (SFR Francois Bonamy (UMS 016), Universidad de Nantes), SFR ICAT (Universidad de Angers), BIO3, HiMolA y SC4BIO. El Inserm UMR_S 1229 RMeS cuenta con el apoyo de subvenciones del Gobierno francés a través de las instituciones Inserm, Nantes Université, Univ Angers y Oniris VetAgroBio. CL también agradece a HTL Biotechnology.
0.20 filters | VWR | 28145-501 | |
18 G needle (1,2×40 mm) | Sterican | 4665120 | |
3 mL syringe | HENKE-JECT | 8300005762 | |
37% hydrochloric acid | VWR | 1.00317.1000 | |
Acetic acid (glacial) | Sigma | A6283 | |
Acetone | VWR | 20063-365 | |
Alcian Blue 8GX | VWR | 361186 | |
Ammonium hydroxide | VWR | 318612 | |
Apatitic tricalcium phosphate | Centre for Biomedical and Healthcare Engineering (Mines Saint Etienne, France) | TV26U | |
Azophloxine | Sigma | 210633 | |
Benzoyl peroxide | Sigma | 8.01641.0250 | |
BMP2 | Medtronic | InductOs 1.5 mg/mL | |
Brillant crocein | Aldrich | 2107507 | |
CTVox | Bruker | – | |
DataViewer | Skyscan | – | |
Diamond blade | Struers | MOD13 | |
Diamond saw | Struers | Accutom-50 | |
DiaPro Mol B3 diamond solution | Struers | 40600379 | |
DiaPro Nap B1 diamond solution | Struers | 40600373 | |
Dibasic sodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma | 102404598 | |
Dibutyl Phtalate | Chimie-Plus Laboratoires | 28656 | |
DragonFly software | ORS | 2022.1.0.1231. | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GlutaMAX(TM), pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
Eosine Y- Surgipath | Sigma | 1002830105 | |
Erythrosin B | Sigma | 102141057 | |
Ethanol absolute | VWR | 20820362 | |
Eukitt | Dutscher | 6.00.01.0003.06.01.01 | |
Falcon 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | |
Ferric chloride hexahydrate (FeCl3, 6H2O) | Merck | 1.03943.0250 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Eurobio | CVFSVF00 | |
Fuchsine acid | Merck | 1.05231.0025 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biosera | MS01NG100J | |
Hematoxylin | Sigma | 86.118.9 | |
Isostatic press | Nova Suisse | Pmax 1500 bars | |
Laser diffraction granulometry | Malvern | Mastersizer 3000 | |
Light green | Prolabo | 28947135 | |
Lithium carbonate | Sigma | A13149 | |
MD-Mol polishing cloth | Struers | 40500077 | |
Methylcyclohexane | VWR | 8.06147.1000 | |
Methylcyclohexane | VWR | 8.06147.1000 | |
Methylcyclohexane | VWR | 8.06147.1000 | |
Methylmethacrylate | Sigma | 8.00590.2500 | |
Micro-CT, micro-scanner | Bruker | Skyscan 1272 | |
Monobasic sodium phosphate (NAH2PO4) | Sigma | 71496 | |
Mortar | Fritsch | Pulverisette 6 | |
N,N, Dimethylanilin | Sigma | 803060 | |
Nanoindentation station | Anton Paar | NHT2 | |
ND-Nap polishing cloth | Struers | 40500080 | |
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 4,75 mm | Arthrex | AR-1981-04S | |
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 8 mm | Arthrex | AR-1981-08S | |
Orange G | Ral | M15 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
Peel-a-way disposable embbedding moulds | Polysciences, Inc | 18646C-1 | |
Penicillin/Streptomycin (P/S) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Phosphomolybdic acid | Sigma | 221856-100 g | |
Phosphotungstic acid | Aldrich | 12863-5 | |
Polishing machine | Sturers | Dap V | |
Poupinel | MEMMERT | TV26U | |
Raman microspectrometer | Renishaw | InVia Qontor | |
Safran du Gâtinais | Labonord | 11507737 | |
Scanning electron microscope | Carl Zeiss | Evo LS 10 | |
SEM | Zeiss | Carl Zeiss Evo LS10 | |
SiC foils/Grinding papers | Struers | 40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000) | |
Silver paint | Electron microscopy sciences | 12686-15 | |
Standard stub with Faraday cup, carbon, aluminium and silicon standards | Micro-Analysis Consultants Ltd | 8602 | |
T25 flask | Corning | 430639 | |
Xylene | VWR | 28975.325 | |
Xylidine Ponceau | Aldrich | 19.976-1 |