Las células cerebelosas de Purkinje (PC) son particularmente sensibles a las deficiencias en la respuesta al daño del ADN. Se presenta un protocolo para la evaluación visual de la dinámica de la respuesta de la PC al daño del ADN, que implica la tinción de cadenas de poli(ADP-ribosa) unidas a proteínas dentro de cultivos organotípicos cerebelosos.
Las células cerebelosas de Purkinje (PC) exhiben una interacción única de altas tasas metabólicas, arquitectura específica de cromatina y una amplia actividad transcripcional, lo que las hace particularmente vulnerables al daño del ADN. Esto requiere una respuesta eficiente al daño del ADN (DDR) para prevenir la degeneración cerebelosa, a menudo iniciada por la disfunción o pérdida del PC. Un ejemplo notable es el síndrome de inestabilidad del genoma, ataxia-telangiectasia (A-T), caracterizado por depleción progresiva de PC y deterioro cerebeloso. La investigación de los mecanismos de DDR en los CP es vital para dilucidar las vías que conducen a su degeneración en estos trastornos. Sin embargo, la complejidad de aislar y cultivar PCs in vitro ha obstaculizado durante mucho tiempo los esfuerzos de investigación. Los cultivos organotípicos cerebelosos murinos (en rodajas) ofrecen una alternativa factible, que imita de cerca el entorno de tejido in vivo . Sin embargo, este modelo se limita a los indicadores de DDR susceptibles de imágenes microscópicas. Hemos refinado el protocolo de cultivo organotípico, demostrando que las imágenes fluorescentes de las cadenas de poli(ADP-ribosa) (PAR) unidas a proteínas, un indicador rápido y temprano de DDR, revelan efectivamente la dinámica de DDR en PC dentro de estos cultivos, en respuesta al estrés genotóxico.
La integridad del ADN celular está constantemente amenazada por agentes que dañan el ADN, predominantemente subproductos metabólicos como las especies reactivas de oxígeno, que infligen decenas de miles de lesiones de ADN por célulaal día. El mantenimiento persistente de la estabilidad del genoma es esencial para la homeostasis celular 2,3. La piedra angular de este mantenimiento es la respuesta al daño del ADN (DDR), una intrincada red de señalización en capas que inicia vías específicas de reparación del ADN mientras ajusta cuidadosamente muchos otros procesos celulares. Los déficits en el DDR se manifiestan comúnmente como “síndromes de inestabilidad del genoma”, caracterizados por inestabilidad cromosómica, deterioro progresivo del tejido, deterioro del crecimiento o desarrollo, predisposición al cáncer y mayor sensibilidad a determinados agentes dañinos para el ADN 6,7,8,9. En particular, la neurodegeneración, que a menudo incluye la atrofia cerebelosa, es una característica distintiva de muchos síndromes de inestabilidad genómica 7,10,11,12.
El trastorno autosómico recesivo, ataxia-telangiectasia (A-T), es un ejemplo bien documentado de trastorno de inestabilidad genómica 13,14,15. Esta condición surge de mutaciones nulas en el gen ATM (A-T, mutado), responsable de codificar la proteína quinasa fundamental, ATM, que se conoce principalmente como movilizador de DDR en respuesta a las roturas de doble cadena de ADN (DSB)16,17. La A-T se manifiesta como un trastorno multisistémico, caracterizado predominantemente por una degeneración cerebelosa progresiva, que conduce a deficiencias motoras agudas, inmunodeficiencia, atrofia gonadal, predisposición al cáncer y sensibilidad extrema a la radiación ionizante. Las células cultivadas de individuos con A-T muestran inestabilidad cromosómica y una mayor sensibilidad a los agentes genotóxicos, especialmente a los causantes de DSBs 15,18,19. Es importante destacar que la ATM también desempeña un papel en la reparación de otras lesiones del ADN, lo que subraya su amplia importancia en el mantenimiento de la estabilidad del genoma 20,21,22.
A pesar de la investigación exhaustiva sobre las numerosas funciones de la ATM, el mecanismo específico que conduce a la degeneración cerebelosa en la A-T sigue siendo un tema de debate activo, con varios modelos propuestos para dilucidar este proceso 23,24,25,26,27,28,29,30. Nuestro modelo28 sugiere que la degeneración cerebelosa en pacientes con A-T comienza con la disfunción y eventual pérdida de células de Purkinje (PC). Teniendo en cuenta el papel fundamental de la ATM en la preservación de la estabilidad del genoma frente a los daños continuos en el ADN, las PC son particularmente vulnerables a la ausencia de ATM. Atribuimos esta vulnerabilidad a la combinación de su alta actividad metabólica, su estructura distintiva de cromatina y su extensa actividad transcripcional. En última instancia, se sugiere que la pérdida de la función de las CP y, por lo tanto, su degeneración, se debe a la inactivación estocástica y funcional de los genes, una consecuencia de la producción de transcripciones defectuosas28.
El estudio de la biología del CP en el laboratorio se ve obstaculizado por los desafíos en el cultivo de PC aislados, ya que estas células dependen en gran medida de su entorno natural y de las células vecinas para sobrevivir y funcionar, lo que las hace incompatibles con el crecimiento de cultivos disociados. No obstante, los PC pueden permanecer viables durante períodos prolongados en cultivos de cortes de tejido. Los cultivos organotípicos cerebelosos, que son cortes de tejido típicamente derivados del cerebelo de roedores, mantienen la organización estructural del tejido y apoyan varias manipulaciones experimentales análogas a las posibles con células cultivadas. Por lo tanto, estos cultivos permiten estudios cerebelosos dentro de un entorno controlado 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Específicamente, en el contexto de A-T, los cultivos organotípicos cerebelosos murinos han demostrado ser fundamentales en la exploración de la DDR en CP deficientes en Atm 40,41,42,43. Mientras que los ratones deficientes en ATM muestran solo un fenotipo cerebeloso sutil 44,45,46,47, presumiblemente debido a las diferencias entre la fisiología cerebelosa humana y de ratón, la suposición es que las funciones de ATM se conservan en gran medida en estas especies. Esta noción está respaldada por nuestras observaciones de que la respuesta deficiente a los DSB de ADN en los CP mat-/- murinos se alinea con la observada en otros tipos de células murinos y humanos deficientes en ATM/Atm 40,41,42,43.
Una limitación en el análisis de las respuestas de la CP a diversos estímulos o tensiones dentro de los cultivos organotípicos es la necesidad de confiar en imágenes microscópicas para las lecturas. La DDR generalmente se estudia utilizando lecturas bioquímicas masivas, aunque también se utilizan marcadores inmunofluorescentes comunes, como el seguimiento de la dinámica de formación y resolución de focos nucleares de la histona H2AX fosforilada (γH2AX) y la proteína 53BP1, que se consideran indicadores de DSB48,49. Una medida más amplia es la obtención de imágenes fluorescentes de la formación de la cadena de poli(ADP-ribosa) (PAR) en las proteínas, una respuesta rápida y robusta al daño temprano del ADN, particularmente a las roturas de hebras 7,50. Modificamos el protocolo de Komulainen et al.51 para la tinción de PAR en cultivos organotípicos cerebelosos. Observamos una respuesta pronunciada a la PAR en los núcleos considerables de los PCs. Aquí se presenta nuestro protocolo refinado para establecer cultivos organotípicos cerebelosos murinos y para visualizar la respuesta de la PAR bajo estrés genotóxico.
Observaciones generales
La principal ventaja del sistema de cultivo organotípico es que facilita los estudios utilizando el tejido de la corteza cerebelosa, preservando su organización estructural durante varias semanas en la configuración de la placa de cultivo. Este sistema es útil para realizar análisis morfológicos en profundidad de las células de Purkinje (PC), incluidos exámenes detallados de las espinas dendríticas y las caracte…
The authors have nothing to disclose.
El trabajo en nuestro laboratorio cuenta con el apoyo de la Fundación de Investigación Médica Dr. Miriam y Sheldon G. Adelson y la Asociación Israelí para la Lucha contra la Enfermedad A-T.
Reagent and Equipment | |||
150 x 30 cm Petri dish | Corning Inc. | 3261 | |
35 x 10 mm Petri dish | Corning Inc. | 3294 | |
Acetone | Invitrogen | 25030081 | |
Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
Adhesive microscope slides | Marienfeld | 48187 | 76 x 26 x 1 mm |
Blades for chopper | TED PELLA | Model TC752-1 | Style Razor Blades |
BME | GIBCO | 41010-026 500ml. | No L-Glut |
Cell culture inserts | Millipore | PICM0RG50 | |
D-Glucose | Biological Indo. | 02-015-1A | |
HBSS w/o phenol red | Sigma-Aldrich | H-1138-500L | No Ca+,No Mg+ |
HBSS with phenol red | Sartorius | 02-015-1A | |
Horse serum | GIBCO | 26050088 | heat inactivated |
Iris forceps | CellPath | GZX-0100-00A | 130mm blunt serrated |
Iris spatula | F.S.T | 10092-12 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 41010026 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 322412-1L | |
Methanol | Sigma-Aldrich | G5767 | |
Microscope | Olympus | ||
Mounting Medium without | GRIGENE. Ltd, Israel | K239320A | |
Paraquat | Sigma-Aldrich | 856177-250MG | Paraquat dichloride (Methyl viologen) |
PARG- Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase inhibitor | Tocris Bioscience, United Kingdom | PDD 00017273 | light sensitive |
Phosphate buffer | Biological Indo. | 02-018-1A | |
Scissors, skin-tissue | |||
Six-well plates | Corning incorporated | CLS3516 | |
Spare Chopping Discs | TED PELLA | Model 10180-01 | |
Tissue chopper | McIlwain | Model TC752 | 10180-220 |
Tweezers, pointed | |||
Urinary cups | |||
Antibodies | |||
Alexa fluor 488 donkey anti Rabbit IgG | Invitrogen |
A21206 | 1:500; secondary ab; Secondary dilution buffer; Incubation for 2 h at room temperature |
Anti glial fibrillary acidic protien | Milliphore | MAB3402 | 1:1500; primary ab; blocking; Host:mouse |
Anti-calbindin-D-28K | Swant | CB300 | 1:2000; primary ab; blocking; host: rabbit |
Anti-calbindin-D-28K | Swant | CB-38a | 1:2000; primary ab; blocking |
Anti-pan-ADP-ribose reagent | Milliphore | MABE1016 | 1:800; primary ab; blocking; incubation for 2 h at room temperature |
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride) | Cell signaling | 4084 | 1:1000; secondary dilution buffer; incubation for 20 min at room temperature |