Infección de pinos in vivo e in vitro con el nematodo del pino Bursaphelenchus xylophilus y aislamiento de volátiles inducidos
Summary
El protocolo describe la infección in vivo e in vitro por el nematodo de la madera de pino Pinus pinaster y su análisis de volatiloma mediante cromatografía de gases (GC) y GC acoplada a espectrometría de masas (GC-MS).
Abstract
El nematodo de la madera del pino (PWN) es un fitoparásito que causa la enfermedad del marchitamiento del pino (PWD) en las especies de coníferas. Este nematodo parásito de plantas ha contribuido en gran medida a la deforestación del pino en países asiáticos, por ejemplo, Japón, China y Corea. En las últimas dos décadas, en Europa, Portugal y España se han visto muy afectados. La investigación sobre los mecanismos de infección por PWN y/o progresión de PWD en especies hospederas susceptibles se basa en la infección controlada de plántulas de pino en condiciones de invernadero. Esta técnica es laboriosa y moviliza importantes recursos económicos y humanos. Además, puede ser propenso a la variabilidad que resulta de la diversidad genética asociada a algunas especies de pino, pero también de la interferencia de factores externos. Como alternativa, los cocultivos in vitro de pino con PWNs ofrecen un sistema más ventajoso para el estudio de los cambios bioquímicos, ya que a) permiten controlar variables ambientales o nutricionales individuales, b) ocupan menos espacio, c) requieren menos tiempo para obtenerse, y d) están libres de contaminación o de variación genética del huésped. El siguiente protocolo detalla la infección estándar in vivo por PWN de Pinus pinaster, el pino marítimo, y el establecimiento de los nuevos cocultivos in vitro de brotes de pino con el PWN como una metodología mejorada para estudiar la influencia de este fitoparásito en los volátiles del pino. Los volátiles inducidos por PWN se extraen de pinos infectados in vivo e in vitro por hidrodestilación y destilación-extracción, y los volátiles emitidos se capturan mediante microextracción en fase sólida (SPME), utilizando técnicas de fibra o columna empaquetada.
Introduction
El nematodo del pino (PWN), Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970, es un nematodo parásito de plantas que parasita principalmente a las especies de Pinus . Este fitoparásito es vectorizado por insectos del género Monochamus a árboles de especies de pino susceptibles durante la alimentación de maduración del insecto. El PWN mata al árbol atacando sus canales de resina y reduciendo el flujo de resina, y dañando su tejido vascular, causando interrupciones en la columna de agua. La falta de agua en la copa de los árboles induce los primeros síntomas visibles de la enfermedad de la marchitez del pino (PWD), es decir, las agujas del pino se vuelven cloróticas después del cese de la fotosíntesis y se caen debido a la desecación. El pino generalmente responde al estrés biótico y abiótico a través de la producción de resina y compuestos volátiles1. Por lo tanto, comprender los mecanismos de defensa del pino es importante para determinar los efectos específicos de los ataques de PWN y encontrar métodos alternativos para el control de plagas2.
Actualmente, la experimentación en condiciones de campo depende de la disponibilidad de pinos infectados, la confirmación de la infección por PWN y las condiciones ambientales variables. En condiciones de invernadero, estos parámetros se pueden controlar más fácilmente; Sin embargo, la diversidad genética del huésped se convierte en una fuerte fuente de variabilidad3. Por ejemplo, en un estudio sobre la respuesta de resistencia de Pinus pinaster, la producción del terpeno limoneno y los ácidos resinosos se asoció con la infección por PWN4. Sin embargo, debido al pequeño número de muestras y a la variabilidad de las condiciones naturales, solo se registraron cambios detectables en la mitad de las muestras. En otro estudio con plántulas de pino cultivadas en invernadero, a pesar de que las condiciones ambientales eran más fácilmente controlables, la diversidad genética natural del pino indujo una gran variabilidad en los volátiles extraídos5. Dado que los volátiles del pino inducidos por enfermedades pueden estar muy influenciados por la variación ambiental y genética, el recurso a los cultivos de brotes in vitro es una buena alternativa para los estudios sobre la respuesta química y bioquímica del tejido del pino a la infección por PWN 5,6. Al propagar un genotipo de planta in vitro, su composición genética puede mantenerse y clonarse indefinidamente, lo que lleva al establecimiento de una mayor cantidad de individuos genéticamente idénticos en menos espacio y en menos tiempo que en condiciones in vivo. Estos cultivos son un sistema de trabajo sencillo bajo condiciones nutricionales y ambientales fácilmente manipulables, por lo que ofrecen ventajas adicionales a los sistemas convencionales en la evaluación de la producción y emisión de volátiles 7,8. Estos sistemas son particularmente ventajosos para la investigación de especies leñosas, que la mayoría de las veces requieren recursos sustanciales, es decir, los árboles objetivo a veces se encuentran en sitios de difícil acceso, requieren equipos costosos, una mano de obra dedicada y períodos de análisis más largos8. In vitro, los cocultivos de pinos con el PWN permiten evaluar las interacciones metabólicas entre el nematodo y la planta en diferentes estadios9. Para el análisis de volátiles, esto es muy importante, ya que las técnicas de elaboración de perfiles se han vuelto muy precisas y las variaciones mínimas en el muestreo pueden dar lugar a cambios sustanciales en los perfiles de volátiles. La cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) es una técnica potente para el análisis de volátiles y permite un perfilado rápido y simplificado de los volátiles10. El protocolo presentado aquí describe técnicas para infectar plántulas de pino in vivo en condiciones de invernadero y cultivos de brotes in vitro de pinos genéticamente idénticos optimizados para la extracción y el perfil de volátiles inducidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado aquí describe una metodología mejorada para analizar compuestos volátiles en pino marítimo infectados por el PWN, donde la variabilidad ambiental y genética se reduce y no influye en los resultados. Utilizando líneas puras de genotipos de pino marítimo in vitro , los volátiles extraídos y emitidos pueden analizarse como respuesta del huésped a una de las amenazas bióticas más dañinas para los bosques de pino.
El ma…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada en parte por la UE en el marco del proyecto PurPest a través del acuerdo de subvención 101060634, y por la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), a través de los proyectos NemACT, DOI 10.54499/2022.00359.CEECIND/CP1737/CT0002; NemaWAARS, DOI 10.54499/PTDC/ASP-PLA/1108/2021; CESAM UIDP/50017/2020+UIDB/50017/2020+ LA/P/0094/2020; CE3C, DOI 10.54499/UIDB/00329/2020; GREEN-IT, DOI 10.54499/UIDB/04551/2020 y 10.54499/UIDP/04551/2020.
Materials
| 38 mesh test sieve | Retsch | 60.131.000038 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BAP) | Duchefa Biochemie | B0904 | |
| Charcoal activated | Duchefa Biochemie | C1302 | |
| Clevenger apparatus | WINZER Laborglastechnik | 25-000-02 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009-500ML | |
| Indole-3-butyric acid (IBA) | Duchefa Biochemie | I0902 | |
| Likens-Nickerson apparatus | VitriLab LDA. | c/IN29/32 | |
| Microbox round containers | Sac O2 | O118/80+OD118 | |
| n-Pentane | Sigma-Aldrich | 1.00882 | |
| PARAFILM M sealing film | BRAND | HS234526B-1EA | |
| Phyto agar | Duchefa Biochemie | P1003 | |
| Potato Dextrose Agar | BD DIFCO | 213400 | |
| Scalpel blade no. 24 | Romed Holland | BLADE24 | |
| Schenk & Hildebrandt Basal salt medium | Duchefa Biochemie | S0225 | |
| Schenk & Hildebrandt vitamin mixture | Duchefa Biochemie | S0411 | |
| SPME fiber assembly Polydimethylsiloxane (PDMS) | Supelco | 57300-U | |
| SPME Fiber Holder | Supelco | 57330-U | |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Tenax TA- stainless steel tubes- conditioned + capped | Markes International | C1-AAXX-5003 |
Referencias
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