Este protocolo describe el diseño, la creación y la aplicación de las fosfatasas reguladas por rapamicina. Este método proporciona una alta especificidad y un estricto control temporal de la activación de la fosfatasa en las células vivas.
Las tirosina fosfatasas son una familia importante de enzimas que regulan funciones fisiológicas críticas. A menudo están desregulados en las enfermedades humanas, lo que los convierte en objetivos clave de los estudios biológicos. Las herramientas que permiten la regulación de la actividad de la fosfatasa son fundamentales en la disección de su función. Los enfoques tradicionales, como la sobreexpresión de mutantes negativos constitutivamente activos o dominantes, o la regulación negativa mediante siRNA, carecen de control temporal. Los inhibidores de la fosfatasa a menudo tienen poca especificidad y solo permiten a los investigadores determinar qué procesos se ven afectados por la inhibición de la fosfatasa.
Desarrollamos un enfoque quimiogenético, el sistema regulado por rapamicina (RapR), que permite la regulación alostérica de un dominio catalítico de fosfatasa que permite un control temporal estricto de la activación de la fosfatasa. El sistema RapR consiste en un dominio iFKBP insertado en un sitio alostérico en la fosfatasa. La dinámica estructural intrínseca del dominio RapR interrumpe el dominio catalítico, lo que lleva a la inactivación de la enzima. La adición de rapamicina media la formación de un complejo entre iFKBP y una proteína FRB coexpresada, que estabiliza la iFKBP y restaura la actividad del dominio catalítico de la fosfatasa.
Este sistema proporciona una alta especificidad y un estricto control temporal de la activación de la fosfatasa en las células vivas. Las capacidades únicas de este sistema permiten la identificación de eventos transitorios y la interrogación de vías de señalización individuales aguas abajo de una fosfatasa. Este protocolo describe las pautas para el desarrollo de una RapR-fosfatasa, su caracterización bioquímica y el análisis de sus efectos sobre la señalización y regulación posteriores de la morfodinámica celular. También proporciona una descripción detallada de una estrategia de ingeniería de proteínas, ensayos in vitro que analizan la actividad de la fosfatasa y experimentos de imágenes de células vivas que identifican cambios en la morfología celular.
Las proteínas tirosina fosfatasas son una familia crítica de proteínas involucradas en una gran cantidad de eventos de señalización celular. Se ha demostrado que desempeñan un papel clave en la regulación de la proliferación, migración y apoptosis celular 1,2,3. En consecuencia, la desregulación de la proteína tirosina fosfatasas conduce a una variedad de enfermedades y trastornos debilitantes 4,5,6,7. El estudio de la función fisiológica de las tirosina fosfatasas y su papel en el desarrollo de estas patologías se ha visto históricamente obstaculizado por la falta de herramientas necesarias para investigar las complejidades de la señalización de la fosfatasa8.
Tradicionalmente, las fosfatasas se estudian utilizando métodos que no tienen la especificidad deseada y/o no proporcionan un control temporal de su actividad. Estas limitaciones críticas de las herramientas disponibles dificultan la disección de las funciones específicas de las fosfatasas en las vías de señalización. La sobreexpresión de mutantes negativos constitutivamente activos y dominantes o la regulación a la baja de la expresión de la fosfatasa proporcionan especificidad, pero carecen de control temporal y, a menudo, pueden desencadenar mecanismos compensatorios que enmascararán la verdadera función de la enzima.
Los inhibidores farmacológicos permiten la regulación temporal de las fosfatasas. Sin embargo, muchos inhibidores de la fosfatasa son notoriamente inespecíficos debido a la composición bien conservada del sitio activo en las tirosina fosfatasas9. Además, debido a las limitaciones de diseño, los inhibidores dirigidos al sitio catalítico exhiben una permeabilidad deficiente de la membrana celular10. Otra limitación de los inhibidores es que solo permiten examinar los efectos de la inactivación de la fosfatasa11. Por lo tanto, existe la necesidad de herramientas que permitan la activación específica y regulable temporalmente de las fosfatasas. Estas herramientas permitirán a los investigadores identificar los efectos directos de la activación de la fosfatasa, separándolos de múltiples cascadas de señalización paralelas a menudo activadas por estímulos biológicos. Es importante destacar que el estricto control temporal de la actividad permite la identificación de eventos transitorios inducidos por una fosfatasa y separa los efectos de la actividad aguda y prolongada de la fosfatasa. La combinación de la regulación temporal con el análisis mutacional permitirá una disección detallada de las funciones específicas de los dominios individuales de la fosfatasa y la interrogación de su señalización posterior12.
Para hacer frente a la falta de capacidades deseadas en las herramientas existentes, el grupo Karginov ha desarrollado el sistema Rapamicina Regulado (RapR) 13,14,15. El sistema RapR utiliza un dominio de conmutación diseñado, iFKBP, que permite la regulación alostérica de la proteína de interés (POI). La inserción del dominio iFKBP en una posición acoplada alostéricamente al sitio catalítico del POI lo hace susceptible a la regulación por rapamicina. En ausencia de rapamicina, iFKBP interrumpe el sitio catalítico debido a la dinámica estructural intrínsecamente alta de iFKBP y, por lo tanto, inactiva el POI. La adición de rapamicina induce la interacción de iFKBP con la proteína FRB coexpresada (Figura 1). Esto provoca la estabilización del dominio del interruptor, lo que en consecuencia restaura la estructura y la función del dominio catalítico del POI. Como tal, la herramienta permite la activación específica y regulable temporalmente del POI.
Figura 1: Esquema del sistema regulado por rapamicina RapR-Shp2. RapR permite la activación alostérica de la proteína de interés con la adición de rapamicina. Esta figura fue modificada de Fauser et al.12. Abreviaturas: iFKBP = FKBP12 insertable; FRB = dominio de unión a FKBP-rapamicina; R = rapamicina; Shp2 = Proteína tirosina fosfatasa que contiene el dominio Src homología-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La herramienta RapR se puede aplicar a diferentes familias de proteínas. Se puede utilizar para regular las proteínas quinasas, así como las fosfatasas12,14. Este protocolo se centrará en la aplicación de la herramienta RapR para el control de la fosfatasa Shp2. Shp2 es una proteína tirosina fosfatasa de expresión ubicua que está involucrada en procesos de señalización como la proliferación, migración, inmunomodulación y diferenciación 1,16,17,18. La desregulación de Shp2 se ha asociado con una serie de cánceres sólidos, leucemia mieloide y trastornos del desarrollo 5,7. Sin embargo, Shp2 ha sido víctima de las mismas deficiencias de la herramienta descritas anteriormente. Para combatir estas limitaciones, se desarrolló y caracterizó RapR-Shp2, un constructo Shp2 específica y temporalmente regulable12.
Antes del desarrollo de RapR-Shp2, se sabía que Shp2 estaba involucrado en la migración celular 19,20,21. Sin embargo, se desconocía su papel específico en la señalización involucrada en este proceso. También se desconocía en qué escala de tiempo Shp2 regula la migración de las células y qué cambios morfodinámicos específicos induce en diferentes momentos de su activación. Además, no estaba claro si la activación aguda y prolongada de Shp2 causará efectos diferentes. Usando RapR-Shp2, se encontró que la activación aguda de Shp2 induce la diseminación celular transitoria, un aumento en las protuberancias, polarización celular y migración. También se identificaron vías específicas aguas abajo de Shp2 que regulan distintos cambios morfodinámicos12. Este protocolo proporciona detalles para el diseño y la caracterización de RapR-Shp2, que se pueden utilizar para guiar el desarrollo y la aplicación de otras fosfatasas de RapR.
Este protocolo proporciona pasos detallados para el desarrollo, la caracterización y la aplicación de fosfatasas controladas quimiogenéticamente. La herramienta RapR-Shp2 se basa en un interruptor regulado por rapamicina insertado en el dominio catalítico Shp2. El punto fuerte de esta herramienta es la especificidad y el estricto control temporal de la actividad de la fosfatasa. La herramienta es aplicable a otras fosfatasas y, en combinación con la tecnología RapR-TAP descrita ant…
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a la Dra. Jordan Fauser por su contribución al desarrollo de RapR-Shp2 y los protocolos asociados. El trabajo fue respaldado por un premio 5R35GM145318 del NIGMS, un premio R33CA258012 del NCI y un premio P01HL151327 del NHLBI.
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0715 | |
1.5 mL Tubes | USA Scientific | cc7682-3394 | |
2x Laemmli Buffer | For 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8 | ||
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Biorad | 4561096 | |
5x Phusion Plus Buffer | Thermo Scientific | F538L | |
A431 Cells | ATCC | CRL-1555 | |
Agarsose | GoldBiotech | A-201 | |
Attofluor Cell Chamber | invitrogen | A7816 | |
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-products | 100-106 | Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered |
Brig 35,30 w/v % | Acros | 329581000 | |
BSA | GoldBiotech | A-420 | |
CellGeo | N/A | N/A | Published in 10.1083/jcb.201306067 |
CellMask Deep Red plasma membrane dye | invitrogen | c10046 | |
Colony Screen MasterMix | Genesee | 42-138 | |
DH5a competent cells | NEB | C2987H | |
DMEM | Corning | 15-013-CV | |
DMSO | Thermo Scientific | F-515 | |
DNA Ladder | GoldBio | D010-500 | |
dNTPs | NEB | N04475 | |
DpnI Enzyme | NEB | R01765 | |
DTT | GoldBio | DTT10 | DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents |
EGTA | Acros | 409910250 | |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | |
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | transfection reagent |
Gel extraction Kit | Thermo Scientific | K0692 | GeneJET Gel Extraction Kit |
Gel Green Nucleic Acid Stain | GoldBio | G-740-500 | |
Gel Loading Dye Purple 6x | NEB | B7024A | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | GlutaMAX-l (100x) 100 mL |
HEK 293T Cells | ATCC | CRL-11268 | |
HeLa Cells | ATCC | CRM-CCL-2 | |
HEPES | Fischer | BP310-500 | |
ImageJ Processing Software | N/A | N/A | |
Igepal CA-630 (NP40) | Sigma | I3021 | |
Imidazole Buffer | 25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT | ||
KCl | Sigma | P-4504 | |
L-15 1x | Corning | 10-045-CV | |
LB Agar | Fisher | BP1425-2 | |
Lysis Buffer | 20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40 | ||
MATLAB | MathWorks | N/A | R 2022b update was used to run CellGeo functions |
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software | N/A | N/A | |
MgCl2 | Fisher Chemical | M33-500 | |
Mineral Oil | Sigma | M5310 | |
MiniPrep Kit | Gene Choice | 96-308 | |
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well | Bio-Rad | 4561085 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CV | |
Multiband Polychroic Mirror | Chroma Technology | 89903BS | |
NaCl | Fisher Chemical | S271-3 | |
Olympus UPlanSAPO 40x objective | Olympus | N/A | |
PBS w/o Ca and Mg | Corning | 21-031-CV | |
PCR Tubes | labForce | 1149Z65 | 0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps |
Phusion Plus DNA Polymerase | Thermo Scientific | F630S | |
Primers | IDT | ||
Protein-G Sepharose | Millipore | 16-266 | |
PVDF Membranes | BioRad | 1620219 | Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches |
Rapamycin | Fisher | AAJ62473MF | |
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium | Corning | 25-053-CI | |
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x | Fischer | BP1332-1 | for electrophoresis |
Wash Buffer | 20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40 | ||
β-Mercaptoethanol | Fisher Chemical | O3446I-100 | |
Antibodies | |||
Anti-EGFR Antibody | Cell Signaling | 2232 | |
Anti-Erk 1/2 Antibody | Cell Signaling | 9102 | |
Anti-Flag Antibody | Millipore-Sigma | F3165 | |
Anti-GAPDH Antibody | invitrogen | AM4300 | |
Anti-GFP Antibody | Clontech | 632380 | |
Anti-mCherry Antibody | invitrogen | M11217 | |
Anti-paxillin Antibody | Thermo Fischer | BDB612405 | |
Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody | Cell Signaling | 2235 | |
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody | Cell Signaling | 9101 | |
Anti-phospho-paxillin Y31 Antibody | Millipore-Sigma | 05-1143 | |
Anti-phospho-PLCγ Y783 Antibody | Cell Signaling | 14008 | |
Anti-PLCγ Antibody | Cell Signaling | 5690 |