Summary

Desarrollo y aplicación de tirosina fosfatasas reguladas por rapamicina

Published: September 06, 2024
doi:

Summary

Este protocolo describe el diseño, la creación y la aplicación de las fosfatasas reguladas por rapamicina. Este método proporciona una alta especificidad y un estricto control temporal de la activación de la fosfatasa en las células vivas.

Abstract

Las tirosina fosfatasas son una familia importante de enzimas que regulan funciones fisiológicas críticas. A menudo están desregulados en las enfermedades humanas, lo que los convierte en objetivos clave de los estudios biológicos. Las herramientas que permiten la regulación de la actividad de la fosfatasa son fundamentales en la disección de su función. Los enfoques tradicionales, como la sobreexpresión de mutantes negativos constitutivamente activos o dominantes, o la regulación negativa mediante siRNA, carecen de control temporal. Los inhibidores de la fosfatasa a menudo tienen poca especificidad y solo permiten a los investigadores determinar qué procesos se ven afectados por la inhibición de la fosfatasa.

Desarrollamos un enfoque quimiogenético, el sistema regulado por rapamicina (RapR), que permite la regulación alostérica de un dominio catalítico de fosfatasa que permite un control temporal estricto de la activación de la fosfatasa. El sistema RapR consiste en un dominio iFKBP insertado en un sitio alostérico en la fosfatasa. La dinámica estructural intrínseca del dominio RapR interrumpe el dominio catalítico, lo que lleva a la inactivación de la enzima. La adición de rapamicina media la formación de un complejo entre iFKBP y una proteína FRB coexpresada, que estabiliza la iFKBP y restaura la actividad del dominio catalítico de la fosfatasa.

Este sistema proporciona una alta especificidad y un estricto control temporal de la activación de la fosfatasa en las células vivas. Las capacidades únicas de este sistema permiten la identificación de eventos transitorios y la interrogación de vías de señalización individuales aguas abajo de una fosfatasa. Este protocolo describe las pautas para el desarrollo de una RapR-fosfatasa, su caracterización bioquímica y el análisis de sus efectos sobre la señalización y regulación posteriores de la morfodinámica celular. También proporciona una descripción detallada de una estrategia de ingeniería de proteínas, ensayos in vitro que analizan la actividad de la fosfatasa y experimentos de imágenes de células vivas que identifican cambios en la morfología celular.

Introduction

Las proteínas tirosina fosfatasas son una familia crítica de proteínas involucradas en una gran cantidad de eventos de señalización celular. Se ha demostrado que desempeñan un papel clave en la regulación de la proliferación, migración y apoptosis celular 1,2,3. En consecuencia, la desregulación de la proteína tirosina fosfatasas conduce a una variedad de enfermedades y trastornos debilitantes 4,5,6,7. El estudio de la función fisiológica de las tirosina fosfatasas y su papel en el desarrollo de estas patologías se ha visto históricamente obstaculizado por la falta de herramientas necesarias para investigar las complejidades de la señalización de la fosfatasa8.

Tradicionalmente, las fosfatasas se estudian utilizando métodos que no tienen la especificidad deseada y/o no proporcionan un control temporal de su actividad. Estas limitaciones críticas de las herramientas disponibles dificultan la disección de las funciones específicas de las fosfatasas en las vías de señalización. La sobreexpresión de mutantes negativos constitutivamente activos y dominantes o la regulación a la baja de la expresión de la fosfatasa proporcionan especificidad, pero carecen de control temporal y, a menudo, pueden desencadenar mecanismos compensatorios que enmascararán la verdadera función de la enzima.

Los inhibidores farmacológicos permiten la regulación temporal de las fosfatasas. Sin embargo, muchos inhibidores de la fosfatasa son notoriamente inespecíficos debido a la composición bien conservada del sitio activo en las tirosina fosfatasas9. Además, debido a las limitaciones de diseño, los inhibidores dirigidos al sitio catalítico exhiben una permeabilidad deficiente de la membrana celular10. Otra limitación de los inhibidores es que solo permiten examinar los efectos de la inactivación de la fosfatasa11. Por lo tanto, existe la necesidad de herramientas que permitan la activación específica y regulable temporalmente de las fosfatasas. Estas herramientas permitirán a los investigadores identificar los efectos directos de la activación de la fosfatasa, separándolos de múltiples cascadas de señalización paralelas a menudo activadas por estímulos biológicos. Es importante destacar que el estricto control temporal de la actividad permite la identificación de eventos transitorios inducidos por una fosfatasa y separa los efectos de la actividad aguda y prolongada de la fosfatasa. La combinación de la regulación temporal con el análisis mutacional permitirá una disección detallada de las funciones específicas de los dominios individuales de la fosfatasa y la interrogación de su señalización posterior12.

Para hacer frente a la falta de capacidades deseadas en las herramientas existentes, el grupo Karginov ha desarrollado el sistema Rapamicina Regulado (RapR) 13,14,15. El sistema RapR utiliza un dominio de conmutación diseñado, iFKBP, que permite la regulación alostérica de la proteína de interés (POI). La inserción del dominio iFKBP en una posición acoplada alostéricamente al sitio catalítico del POI lo hace susceptible a la regulación por rapamicina. En ausencia de rapamicina, iFKBP interrumpe el sitio catalítico debido a la dinámica estructural intrínsecamente alta de iFKBP y, por lo tanto, inactiva el POI. La adición de rapamicina induce la interacción de iFKBP con la proteína FRB coexpresada (Figura 1). Esto provoca la estabilización del dominio del interruptor, lo que en consecuencia restaura la estructura y la función del dominio catalítico del POI. Como tal, la herramienta permite la activación específica y regulable temporalmente del POI.

Figure 1
Figura 1: Esquema del sistema regulado por rapamicina RapR-Shp2. RapR permite la activación alostérica de la proteína de interés con la adición de rapamicina. Esta figura fue modificada de Fauser et al.12. Abreviaturas: iFKBP = FKBP12 insertable; FRB = dominio de unión a FKBP-rapamicina; R = rapamicina; Shp2 = Proteína tirosina fosfatasa que contiene el dominio Src homología-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La herramienta RapR se puede aplicar a diferentes familias de proteínas. Se puede utilizar para regular las proteínas quinasas, así como las fosfatasas12,14. Este protocolo se centrará en la aplicación de la herramienta RapR para el control de la fosfatasa Shp2. Shp2 es una proteína tirosina fosfatasa de expresión ubicua que está involucrada en procesos de señalización como la proliferación, migración, inmunomodulación y diferenciación 1,16,17,18. La desregulación de Shp2 se ha asociado con una serie de cánceres sólidos, leucemia mieloide y trastornos del desarrollo 5,7. Sin embargo, Shp2 ha sido víctima de las mismas deficiencias de la herramienta descritas anteriormente. Para combatir estas limitaciones, se desarrolló y caracterizó RapR-Shp2, un constructo Shp2 específica y temporalmente regulable12.

Antes del desarrollo de RapR-Shp2, se sabía que Shp2 estaba involucrado en la migración celular 19,20,21. Sin embargo, se desconocía su papel específico en la señalización involucrada en este proceso. También se desconocía en qué escala de tiempo Shp2 regula la migración de las células y qué cambios morfodinámicos específicos induce en diferentes momentos de su activación. Además, no estaba claro si la activación aguda y prolongada de Shp2 causará efectos diferentes. Usando RapR-Shp2, se encontró que la activación aguda de Shp2 induce la diseminación celular transitoria, un aumento en las protuberancias, polarización celular y migración. También se identificaron vías específicas aguas abajo de Shp2 que regulan distintos cambios morfodinámicos12. Este protocolo proporciona detalles para el diseño y la caracterización de RapR-Shp2, que se pueden utilizar para guiar el desarrollo y la aplicación de otras fosfatasas de RapR.

Protocol

1. Diseño de RapR-fosfatasas PlanificaciónNOTA: Usando RapR-Shp2 como ejemplo, este protocolo detalla los pasos importantes para crear una tirosina fosfatasa regulada por rapamicina. El protocolo descrito está optimizado para Shp2 y es posible que se necesiten modificaciones adicionales para adaptarse a las propiedades específicas de las fosfatasas individuales.Para asegurar que la actividad catalítica de Shp2 esté puramente controlada por la …

Representative Results

La Figura 4 muestra los resultados que se pueden esperar del ensayo de actividad de fosfatasa basado en paxilina. En este experimento, se comparó la actividad de la fosfatasa Shp2 negativa constitutivamente activa y dominante con la de RapR-Shp2 activa e inactiva utilizando fosfopaxilina como lectura. Los constructos Shp2 fueron inmunoprecipitados y sometidos al ensayo de actividad descrito en el protocolo. Las lecturas de fosfo-paxilina para Shp2 constitut…

Discussion

Este protocolo proporciona pasos detallados para el desarrollo, la caracterización y la aplicación de fosfatasas controladas quimiogenéticamente. La herramienta RapR-Shp2 se basa en un interruptor regulado por rapamicina insertado en el dominio catalítico Shp2. El punto fuerte de esta herramienta es la especificidad y el estricto control temporal de la actividad de la fosfatasa. La herramienta es aplicable a otras fosfatasas y, en combinación con la tecnología RapR-TAP descrita ant…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a la Dra. Jordan Fauser por su contribución al desarrollo de RapR-Shp2 y los protocolos asociados. El trabajo fue respaldado por un premio 5R35GM145318 del NIGMS, un premio R33CA258012 del NCI y un premio P01HL151327 del NHLBI.

Materials

#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round Warner Instruments 64-0715
1.5 mL Tubes USA Scientific cc7682-3394
2x Laemmli Buffer For 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel Biorad 4561096
5x Phusion Plus Buffer Thermo Scientific F538L
A431 Cells ATCC CRL-1555
Agarsose GoldBiotech A-201
Attofluor Cell Chamber invitrogen A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-products 100-106 Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
Brig 35,30 w/v % Acros 329581000
BSA GoldBiotech A-420
CellGeo N/A N/A Published in 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dye invitrogen c10046
Colony Screen MasterMix Genesee 42-138
DH5a competent cells NEB C2987H
DMEM Corning 15-013-CV
DMSO Thermo Scientific F-515
DNA Ladder GoldBio D010-500
dNTPs NEB N04475
DpnI Enzyme NEB R01765
DTT GoldBio DTT10 DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA Acros 409910250
Fibronectin from bovine plasma Sigma F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent Promega E2692 transfection reagent
Gel extraction Kit Thermo Scientific K0692 GeneJET Gel Extraction Kit
Gel Green Nucleic Acid Stain GoldBio G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x NEB B7024A
Glutamax Gibco 35050-061 GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells ATCC CRL-11268
HeLa Cells ATCC CRM-CCL-2
HEPES Fischer BP310-500
ImageJ Processing Software N/A N/A
Igepal CA-630 (NP40) Sigma I3021
Imidazole Buffer 25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl Sigma P-4504
L-15 1x Corning 10-045-CV
LB Agar Fisher BP1425-2
Lysis Buffer 20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLAB MathWorks N/A R 2022b update was used to run CellGeo functions
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software N/A N/A
MgCl2 Fisher Chemical M33-500
Mineral Oil Sigma M5310
MiniPrep Kit Gene Choice 96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well Bio-Rad 4561085
Molecular Biology Grade Water Corning 46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror Chroma Technology 89903BS
NaCl Fisher Chemical S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objective Olympus N/A
PBS w/o Ca and Mg Corning 21-031-CV
PCR Tubes labForce 1149Z65 0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase Thermo Scientific F630S
Primers IDT
Protein-G Sepharose Millipore 16-266
PVDF Membranes BioRad 1620219 Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
Rapamycin Fisher AAJ62473MF
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium Corning 25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x Fischer BP1332-1 for electrophoresis
Wash Buffer 20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-Mercaptoethanol Fisher Chemical O3446I-100
Antibodies
Anti-EGFR Antibody Cell Signaling 2232
Anti-Erk 1/2 Antibody Cell Signaling 9102
Anti-Flag Antibody Millipore-Sigma F3165
Anti-GAPDH Antibody invitrogen AM4300
Anti-GFP Antibody Clontech 632380
Anti-mCherry Antibody invitrogen M11217
Anti-paxillin Antibody Thermo Fischer BDB612405
Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody Cell Signaling 2235
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody Cell Signaling 9101
Anti-phospho-paxillin Y31 Antibody Millipore-Sigma 05-1143
Anti-phospho-PLCγ Y783 Antibody Cell Signaling 14008
Anti-PLCγ Antibody Cell Signaling 5690

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Szynal, B. N., Bradford-Olson, H., Karginov, A. V. Development and Application of Rapamycin-regulated Tyrosine Phosphatases. J. Vis. Exp. (211), e67142, doi:10.3791/67142 (2024).

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