Este protocolo presenta un método para generar organoides vasculares utilizando células madre pluripotentes humanas.
Los organoides vasculares derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) recapitulan la diversidad de tipos celulares y la compleja arquitectura de las redes vasculares humanas. Este modelo tridimensional (3D) tiene un potencial sustancial para el modelado de patologías vasculares y el cribado de fármacos in vitro . A pesar de los avances recientes, sigue existiendo un desafío técnico clave en la generación reproducible de organoides con una calidad constante, que es crucial para los ensayos y aplicaciones posteriores. Aquí, se presenta un protocolo modificado que mejora tanto la homogeneidad como la reproducibilidad de la generación de organoides vasculares. El protocolo modificado incorpora el uso de micropocillos y el cóctel CEPT (croma 1, emricasan, poliaminas y el inhibidor integrado de la respuesta al estrés, trans-ISRIB) para mejorar la formación de cuerpos embrioides y la supervivencia celular. Los organoides vasculares maduros y diferenciados generados mediante este protocolo se caracterizan mediante microscopía de inmunofluorescencia 3D de montaje completo para analizar su morfología y vasculatura compleja. Este protocolo permite la producción de organoides vasculares de alta calidad de forma escalable, lo que podría facilitar su uso en aplicaciones de modelado de enfermedades y cribado de fármacos.
En la última década han surgido modelos microfisiológicos in vitro, incluidos los sistemas de organoides y tejidos en un chip 1,2,3. Estos sistemas tridimensionales (3D) derivados de células humanas abordan las limitaciones del cultivo celular bidimensional (2D) convencional y de los modelos animales, como la falta de muchos componentes en el microambiente fisiológico y las diferencias genéticas entre especies, respectivamente. Proporcionan más información fisiológica y son más adecuados para el modelado de enfermedades y el cribado de fármacos que los modelos convencionales. Entre los modelos microfisiológicos, se ha demostrado que los organoides derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) recapitulan eficazmente las características arquitectónicas de los tejidos humanos nativos y se han desarrollado para imitar diferentes órganos humanos, incluyendo el cerebro 4,5, el riñón6, el hígado 7,8 y la retina9. Aquí, nos centramos especialmente en la generación de organoides vasculares a partir de hiPSCs y esbozamos un protocolo simplificado que tiene como objetivo minimizar las variaciones entre diferentes muestras y lotes de organoides, mejorando así la reproducibilidad general.
La vasculatura desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis fisiológica en todos los órganos humanos. La formación de la vasculatura involucra los procesos de vasculogénesis y angiogénesis, orquestados a través de las interacciones entre las células endoteliales y murales (por ejemplo, pericitos y células del músculo liso vascular) e influenciados por diversos estímulos10. Penninger, Wimmer y sus colegas desarrollaron el primer método de generación de organoides vasculares11,12 que imita estos dos procesos. Con los organoides generados a partir de este método, su grupo12 y nosotros13,14 han demostrado el potencial de los organoides vasculares para modelar las disfunciones vasculares en las enfermedades. Por ejemplo, en nuestros trabajos recientes 13,14, se observaron fenotipos distintos, como la brotación de vasos y las variaciones en la composición de las células murales, entre los organoides vasculares que imitan la enfermedad y sus contrapartes de tipo salvaje. Estos ejemplos ponen de manifiesto que el modelo de organoide vascular podría servir como plataforma para el cribado de fármacos al imitar las disfunciones vasculares relacionadas con la enfermedad.
A partir de los trabajos iniciales de generación de organoides vasculares11,12, se presenta un protocolo revisado que incluye el uso de micropocillos para facilitar la formación homogénea de cuerpos embrioides (EB), un factor crítico para minimizar las variaciones que a menudo se observan dentro del mismo lote de generación de organoides. Además, el cóctel CEPT, una combinación de cromán 1, emicasano, poliaminas y el inhibidor integrado de la respuesta al estrés (trans-ISRIB)15, se emplea para mejorar la viabilidad de las hiPSC y las células diferenciadas durante el proceso de formación de EB. Esta modificación es principalmente para reducir las variaciones entre diferentes muestras y lotes de organoides. Se pueden producir organoides vasculares uniformes con este protocolo de aproximadamente dos semanas de duración, donde se induce la vasculogénesis para ayudar al endotelio a organizarse en redes tubulares primitivas el día 1, seguido de la inducción de la angiogénesis el día 5 para desarrollar redes vasculares complejas en los organoides. En el día 12-15, los organoides generados deben mostrar redes vasculares maduras compuestas por endotelio y células murales.
El protocolo descrito incluye dos modificaciones clave para la generación homogénea y reproducible de organoides vasculares de alta calidad. La primera modificación es el uso de una placa de micropocillos para permitir un mejor control de la uniformidad del EB. Como punto de partida de la diferenciación vascular, el tamaño de las EB es crítico, ya que regula el destino de las células madre y la eficacia de la diferenciación hacia diferentes linajes. Las variaciones en el tamaño …
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer el apoyo técnico del Recurso Compartido de Microscopía Confocal y Especializada del Centro Oncológico Integral Herbert Irving de la Universidad de Columbia, financiado en parte a través de la Subvención del Centro de los NIH (P30CA013696). Este trabajo cuenta con el apoyo de los NIH (R21NS133635, Y.-H.L.; UH3TR002151, K. W. L.). La Figura 1A se creó utilizando BioRender.
2-Mercaptoethanol (1000x) | Gibco | 21985023 | |
Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | |
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Labs | 711-546-152 | reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol, store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000 |
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Labs | 705-606-147 | reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol, store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000 |
B27 supplement minus vitamin A (50x) | Gibco | 12587010 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle |
BMP4 | ProSpec | CYT-081 | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C |
CD31 antibody | abcam | ab28364 | dilution ratio: 1:400 |
Centrifuge | Eppendorf | 022626001 | |
CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423/10 | make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year. |
Chroman 1 | Tocris | 7163/10 | make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year. |
Collagen I | Corning | 40236 | |
Confocal Microscope | Nikon | AXRMP/Ti2 | |
Corning Elplasia Plates | Corning | 4441 | |
Countess II FL automated cell counter | Thermo Fisher | AMQAF1000 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | |
DMEM/F-12, powder | Gibco | 12500062 | make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C. |
Edi042A | Cedars Sinai | ||
Emricasan | Medchemexpress LLC | HY1039610MG | make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year. |
ERG antibody | Cell Singali Technology | 97249 | dilution ratio: 1:400 |
Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | thaw at 4 °C and aliquot, store at -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month |
FGF2 | ProSpec | CYT557 | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C |
Fluorodish Cell Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C |
Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15710064 | |
GlutaMAX supplement (100x) | Gibco | 35050061 | |
Heparin, 100 kU | MilliporeSigma | 375095100KU | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL |
HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
Incubator | Thermo Scientific | 13998123 | |
Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828028 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle |
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix | Corning | 356230 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x) | Gibco | 11140050 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 46000CV | |
mTeSR plus kit | STEMCELL Technologies | 1001130 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle |
N2 supplement (100x) | Gibco | 17502048 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle |
NaOH solution (1 M) | Cytiva HyClone | SH31088.01 | |
NeuroBasal medium | Gibco | 21103049 | |
NIS-Elements, ver 5.42 | Nikon | ||
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research Labs | 17000121 | reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks |
paraformaldehyde, 20% | Electron Microscopy Sciences | 15713S | dilute with PBS |
PBST, 20x | Thermofisher | 28352 | |
PDGFRβ antibody | R&D | AF385 | dilution ratio: 1:400 |
polyamine supplement (1000x) | Sigma-Aldrich | P8483 | |
Rapiclear clearing reagent, 1.49 | SUNJIN LAB | RC149001 | |
Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080094 | |
Sodium deoxycholate monohydrate | Thermofisher | J6228822 | dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution |
TBST, 20x | Thermofisher | 28360 | |
trans-ISRIB | Tocris Bioscience | 5284/10 | make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year. |
Tritin X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher | 15250061 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
VEGF-A | ProSpec | CYT-116 | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C |