Summary

Generación de organoides vasculares a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Published: December 13, 2024
doi:

Summary

Este protocolo presenta un método para generar organoides vasculares utilizando células madre pluripotentes humanas.

Abstract

Los organoides vasculares derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) recapitulan la diversidad de tipos celulares y la compleja arquitectura de las redes vasculares humanas. Este modelo tridimensional (3D) tiene un potencial sustancial para el modelado de patologías vasculares y el cribado de fármacos in vitro . A pesar de los avances recientes, sigue existiendo un desafío técnico clave en la generación reproducible de organoides con una calidad constante, que es crucial para los ensayos y aplicaciones posteriores. Aquí, se presenta un protocolo modificado que mejora tanto la homogeneidad como la reproducibilidad de la generación de organoides vasculares. El protocolo modificado incorpora el uso de micropocillos y el cóctel CEPT (croma 1, emricasan, poliaminas y el inhibidor integrado de la respuesta al estrés, trans-ISRIB) para mejorar la formación de cuerpos embrioides y la supervivencia celular. Los organoides vasculares maduros y diferenciados generados mediante este protocolo se caracterizan mediante microscopía de inmunofluorescencia 3D de montaje completo para analizar su morfología y vasculatura compleja. Este protocolo permite la producción de organoides vasculares de alta calidad de forma escalable, lo que podría facilitar su uso en aplicaciones de modelado de enfermedades y cribado de fármacos.

Introduction

En la última década han surgido modelos microfisiológicos in vitro, incluidos los sistemas de organoides y tejidos en un chip 1,2,3. Estos sistemas tridimensionales (3D) derivados de células humanas abordan las limitaciones del cultivo celular bidimensional (2D) convencional y de los modelos animales, como la falta de muchos componentes en el microambiente fisiológico y las diferencias genéticas entre especies, respectivamente. Proporcionan más información fisiológica y son más adecuados para el modelado de enfermedades y el cribado de fármacos que los modelos convencionales. Entre los modelos microfisiológicos, se ha demostrado que los organoides derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) recapitulan eficazmente las características arquitectónicas de los tejidos humanos nativos y se han desarrollado para imitar diferentes órganos humanos, incluyendo el cerebro 4,5, el riñón6, el hígado 7,8 y la retina9. Aquí, nos centramos especialmente en la generación de organoides vasculares a partir de hiPSCs y esbozamos un protocolo simplificado que tiene como objetivo minimizar las variaciones entre diferentes muestras y lotes de organoides, mejorando así la reproducibilidad general.

La vasculatura desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis fisiológica en todos los órganos humanos. La formación de la vasculatura involucra los procesos de vasculogénesis y angiogénesis, orquestados a través de las interacciones entre las células endoteliales y murales (por ejemplo, pericitos y células del músculo liso vascular) e influenciados por diversos estímulos10. Penninger, Wimmer y sus colegas desarrollaron el primer método de generación de organoides vasculares11,12 que imita estos dos procesos. Con los organoides generados a partir de este método, su grupo12 y nosotros13,14 han demostrado el potencial de los organoides vasculares para modelar las disfunciones vasculares en las enfermedades. Por ejemplo, en nuestros trabajos recientes 13,14, se observaron fenotipos distintos, como la brotación de vasos y las variaciones en la composición de las células murales, entre los organoides vasculares que imitan la enfermedad y sus contrapartes de tipo salvaje. Estos ejemplos ponen de manifiesto que el modelo de organoide vascular podría servir como plataforma para el cribado de fármacos al imitar las disfunciones vasculares relacionadas con la enfermedad.

A partir de los trabajos iniciales de generación de organoides vasculares11,12, se presenta un protocolo revisado que incluye el uso de micropocillos para facilitar la formación homogénea de cuerpos embrioides (EB), un factor crítico para minimizar las variaciones que a menudo se observan dentro del mismo lote de generación de organoides. Además, el cóctel CEPT, una combinación de cromán 1, emicasano, poliaminas y el inhibidor integrado de la respuesta al estrés (trans-ISRIB)15, se emplea para mejorar la viabilidad de las hiPSC y las células diferenciadas durante el proceso de formación de EB. Esta modificación es principalmente para reducir las variaciones entre diferentes muestras y lotes de organoides. Se pueden producir organoides vasculares uniformes con este protocolo de aproximadamente dos semanas de duración, donde se induce la vasculogénesis para ayudar al endotelio a organizarse en redes tubulares primitivas el día 1, seguido de la inducción de la angiogénesis el día 5 para desarrollar redes vasculares complejas en los organoides. En el día 12-15, los organoides generados deben mostrar redes vasculares maduras compuestas por endotelio y células murales.

Protocol

La Figura 1 presenta una descripción general de los pasos involucrados en este protocolo. La información detallada sobre los reactivos y materiales utilizados en este protocolo se proporciona en la Tabla de Materiales. Se recomienda que todos los medios se precalienten a 37 °C antes de su uso, a menos que se especifique lo contrario. Todos los materiales y suministros de cultivo celular deben ser esterilizados en autoclave, y el manejo de las células debe realizarse en un gabinete de bioseguridad. Además, el valor de pH de la mezcla de colágeno I debe ajustarse cuidadosamente a un pH de 7,3 para evitar posibles problemas de solidificación. 1. Mantenimiento de iPSC humano Descongele el extracto de la matriz de membrana basal en hielo, agite suavemente el frasco para mezclar la solución y haga alícuotas de 0,5 ml en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con una pipeta P1000 y puntas prerefrigeradas. Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de 1 año. Descongele una alícuota de extracto de matriz (0,5 mL) en hielo. Mezclar con 49,5 mL de medio DMEM/F12 preenfriado en un tubo de 50 mL. Distribuya la mezcla a cada pocillo (1,5 mL/pocillo) en placas de 6 pocillos y luego agite suavemente la placa para asegurarse de que la solución líquida cubra todo el pocillo. Selle las placas con film de parafina y guárdelas a 4 °C durante un máximo de 1 semana. Prepare el medio de expansión hiPSC como se describe en la Tabla 1. Prepare alícuotas del medio completo (40 mL/tubo) y almacene a -20 °C hasta por 1 año. Coloque una placa prerrevestida en la incubadora a 37 °C durante 1 h antes del cultivo de hiPSC. Precaliente el medio de expansión hiPSC (40 mL) a 37 °C y prepare el medio de siembra hiPSC como se describe en la Tabla 2. Transfiera la placa recubierta de la incubadora a 37 °C a la cabina de bioseguridad. Reemplace el medio en la placa recubierta con medio de siembra hiPSC (1 mL/pocillo). Descongele un vial criopreservado de hiPSC del tanque criogénico en un baño de agua a 37 °C durante 1 min. Transfiera las células a un tubo de 15 mL y luego agregue 5 mL de medio DMEM/F12, seguido de una centrifugación a 100 x g durante 3 min a temperatura ambiente para recolectar las células. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células con 1,5 mL de medio de siembra hiPSC. Vuelva a suspender suavemente las células en el tubo de 15 ml. Aliquotar 10 μL de la suspensión celular y mezclar con 10 μL de solución de azul de tripano. Transfiera la mezcla de 10 μL al portaobjetos del hematocitómetro y cúbralo con un cubreobjetos. Monte la corredera en el soporte e insértela en el contador de celdas automatizado. Espere a que el instrumento encuentre el enfoque o ajuste manualmente el enfoque presionando el botón de enfoque +/- en la pantalla. Luego, use la configuración predeterminada y presione el botón Capturar . Utilice la lectura de la densidad de células vivas como la concentración de la suspensión de hiPSC preparada a partir del paso 1.9. Siembre 2 × 105 celdas en cada pocillo y asegúrese de que las celdas se distribuyan uniformemente en el pocillo. Cultive las células a 37 °C con 5% de CO2 y reemplace el medio con medio de expansión hiPSC (1,5 mL/pocillo) después de 24 h. Cambie el medio diariamente hasta que las células alcancen una confluencia del 80%. Compruebe la morfología de la célula y el tamaño de la colonia de forma rutinaria para asegurarse de que no haya diferenciación espontánea. Deseche el cultivo y reinicie con un nuevo lote de hiPSCs si se observa una diferenciación espontánea extensa (>5%). 2. Formación EB (Día 0) El día 0, prepare y precaliente el medio DMEM/F12, el medio de siembra hiPSC y la solución de desprendimiento de celdas a 37 °C durante 20-30 min. Retire el medio de cultivo de la placa de 6 pocillos y agregue una solución de desprendimiento de células precalentada (1,5 mL/pocillo). Incubar la placa a 37 °C durante 5-7 min. Transfiera la placa a la cabina de bioseguridad, golpee la placa para separar las colonias de hiPSC y rompa los agregados. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mL. Añadir 4,5 mL de medio DMEM/F12. Pipetear suavemente la mezcla hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica de 10 ml cinco veces para disociar las células en una suspensión de una sola célula. Evita generar burbujas. Centrifugar a 100 x g durante 3 min a temperatura ambiente para recoger las células. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente las células con 1 mL de medio de siembra hiPSC utilizando una pipeta P1000. Mezcle 10 μL de suspensión celular con 10 μL de solución de azul de tripano para el recuento de células. Transfiera 10 μL de la mezcla al portaobjetos del hematocitómetro y cúbralo con un cubreobjetos. Monte la corredera en el soporte e insértela en el contador de celdas automatizado. Después de que el instrumento encuentre el enfoque, presione el botón Capturar y use la lectura de densidad celular EN VIVO para determinar la concentración de la suspensión hiPSC. Siembre las células en la placa de micropocillos de fondo redondo de ultra baja adherencia con una densidad de 2,7 × 105 células/pocillo para producir entre 500 y 1.000 células por EB. Agregue 2 mL de medio de siembra hiPSC a cada pocillo y mezcle la solución suavemente para distribuir las células de manera uniforme. Cultivar las células a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h. 3. Diferenciación vascular (Día 1 – 5) El día 1, prepare el medio de inducción del mesodermo (MIM) como se describe en la Tabla 3 y la Tabla 4 y precaliéntelo a 37 °C durante 20 min. El medio MIM debe estar hecho fresco. Utilice una pipeta P200 para aspirar cuidadosamente el medio de la placa de micropocillos sin alterar los EB del fondo. Añada 2,5 mL de MIM lentamente con una pipeta P200. Cultivar los EBs en MIM a 37 °C con 5% de CO2 durante 2 días. En el día 3, reemplace suavemente el medio con 2,5 mL precalentados y recién hechos del medio de diferenciación vascular 1 (VDM1, Tabla 5) sin alterar los EB en el fondo del micropocillo. Cultive las células a 37 °C con 5% de CO2 durante otros 2 días. 4. Inclusión de hidrogel (Día 5) Prepare la mezcla de colágeno I como se describe en la Tabla 6. Coloque un tubo de 50 ml sobre hielo y agregue la solución de colágeno I, H2O, medio DMEM 10× / F12, bicarbonato de sodio y HEPES posteriormente. Mezcle bien agitando el tubo suavemente. Agregue 1 M de solución de NaOH gota a gota mientras agita la solución mezclada para ajustar el valor de pH a 7.3 y verifique el valor de pH de la mezcla con un medidor de pH.NOTA: Todas las soluciones deben enfriarse previamente en hielo antes de su uso. Realice el procedimiento en hielo en la cabina de bioseguridad todo el tiempo. La adición de la solución de NaOH es fundamental, y se necesita una dispersión rápida para crear una solución homogénea para evitar el curado local del colágeno I. El volumen de NaOH puede variar según el número de lote de la solución de colágeno I utilizada. No pipetee vigorosamente para mezclar, ya que el esfuerzo cortante podría causar un precurado no deseado. Prepare la mezcla de matriz de colágeno I-membrana basal como se describe en la Tabla 7. Añadir 1,25 mL de matriz de membrana basal a la mezcla de 5 mL de colágeno I preparada a partir del paso 4.1. Mezcle la solución suavemente agitando el tubo. Coloque un plato de 12 pocillos sobre hielo durante 2 min. Agregue lentamente la mezcla de matriz de membrana basal de colágeno I a la placa de 12 pocillos (1,5 mL/pocillo) utilizando las puntas de diámetro ancho. Asegúrate de que la mezcla se distribuya uniformemente. Coloque la placa en la incubadora a 37 °C durante 2 h para solidificar la primera capa de hidrogel. Mantenga la mezcla restante de la matriz de la membrana basal de colágeno I en hielo para su uso posterior. Transfiera ~ 60 agregados de celdas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y enfríe el tubo con hielo durante 5 minutos. Retire con cuidado el medio con una punta de pipeta P200.NOTA: Inicie este paso 1,5 horas después del paso 4.5. Gota a gota, añada 1,5 ml de mezcla de colágeno I-membrana basal a los agregados y mézclelos suavemente con las puntas de pipeta P200 de diámetro ancho. Transfiera la placa con la primera capa de hidrogel de la incubadora (paso 4.5) a la cabina de bioseguridad. Añadir 1,5 mL de la suspensión de áridos sobre la capa curada. Agite suavemente la placa para distribuir los agregados de manera uniforme. Evite generar burbujas. Incubar la placa a 37 °C con 5% de CO2 durante otras 2 h. Preparar el medio de diferenciación vascular 2 (VDM2; Tabla 8) y precalentar el medio en un baño de agua a 37 °C durante 20 minutos antes de su uso. Añadir 2 mL de VDM2 a cada pocillo y cultivar las células a 37 °C con 5% de CO2. Cambie el medio cada 3 días con VDM2 precalentado y recién hecho.NOTA: (Opcional) Los organoides vasculares pueden liberarse de la mezcla de gel retirando el gel con una aguja de jeringa. Los organoides vasculares recuperados del gel se pueden mantener individualmente en una placa de 96 pocillos con VDM2 (200 μL/pocillo). Cambie el medio cada 2-3 días. 5. 3D Ensayo inmunofluorescente Los organoides vasculares deben madurar aproximadamente el día 13. En el caso de los organoides incrustados en el hidrogel, aspire el medio con cuidado y lávese con 2 ml de PBS tres veces (10 min cada vez). En el caso de los organoides extraídos del gel (después del paso 4.14), recoja de 6 a 10 organoides en un tubo de microcentrífuga de 2 ml, aspire el medio y lave con 2 ml de PBS tres veces (10 min cada una). Añadir 2 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% a la muestra e incubar a 4 °C durante la noche con sellado de película de parafina. Retire la solución de PFA y lave la muestra con 2 mL de PBS cuatro veces (15 min cada vez). Añadir 2 mL de tampón de bloqueo (Tabla 9) e incubar a temperatura ambiente durante 2 h. Retire el tampón de bloqueo y agregue 1,5 mL de anticuerpos primarios (consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre anticuerpos; los anticuerpos deben diluirse en el tampón de bloqueo). Incubar la muestra con anticuerpos primarios a 4 °C durante 2 días agitando suavemente.NOTA: Se recomienda diluir el anticuerpo primario (CD31, PDGFRβ y ERG1) en el tampón de bloqueo en una proporción de 1:400 (consulte la Tabla de materiales para obtener más información). Retire la solución de anticuerpos primarios y lávese con 2 ml de PBST durante 1 h seis veces. Añada 2 mL de anticuerpos secundarios (consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre anticuerpos; los anticuerpos deben diluirse en PBST) a la muestra. Envuelva la placa con papel de aluminio e incube a 4 °C durante 2 días agitando suavemente.NOTA: Se recomienda diluir el anticuerpo secundario en PBST en una proporción de 1:1000 (consulte la Tabla de materiales para obtener más información). Mantenga la placa alejada de la luz durante la incubación y lave a partir de este paso después. Retire la solución de anticuerpos secundarios y lávese con 2 ml de TBST seis veces (1 h cada vez). Agregue DAPI (1 μg/mL) en el tampón de lavado utilizado para el último paso de lavado si es necesario tintar los núcleos. Para estos organoides incrustados en gel, corte el gel en 4 trozos y transfiéralos con cuidado a tubos de microcentrífuga de 2 ml con una espátula. Para los organoides recuperados, retire el tampón de lavado. Use toallitas para absorber la solución restante sin tocar el gel o los organoides. Añada 2 ml de reactivo de limpieza de tejidos soluble en agua (índice de refracción = 1,49) a cada tubo. Incubar las muestras con reactivo de aclarado a temperatura ambiente en la oscuridad hasta que los organoides se aclaren (generalmente durante la noche). No agite las muestras. Transfiera los organoides con el reactivo de aclarado con cuidado al centro del plato con fondo de vidrio con una espátula. Cubra los organoides o la pieza de gel con un cubreobjetos de 24 mm × 24 mm. Empuje suavemente el cubreobjetos hacia abajo hasta que quede plano y coloque las muestras con el fondo de vidrio. Retire el reactivo limpiador redundante de la placa y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas. Para obtener imágenes en 3D, utilice un microscopio confocal con un objetivo de 10×. Utilice el escaneo de mosaicos y el escaneo de pila Z para obtener imágenes de montaje completo de organoides.

Representative Results

La Figura 1A presenta el esquema de este protocolo, incluidos los componentes clave utilizados en cada etapa. La diferenciación comenzó con la formación de EB, seguida de la inducción del mesodermo y la especificación del linaje vascular (Figura 1B-D). Los agregados se hicieron más grandes y menos esféricos con el tiempo. Los organoides comenzaron a mostrar bordes ásperos el día 5. Desp…

Discussion

El protocolo descrito incluye dos modificaciones clave para la generación homogénea y reproducible de organoides vasculares de alta calidad. La primera modificación es el uso de una placa de micropocillos para permitir un mejor control de la uniformidad del EB. Como punto de partida de la diferenciación vascular, el tamaño de las EB es crítico, ya que regula el destino de las células madre y la eficacia de la diferenciación hacia diferentes linajes. Las variaciones en el tamaño …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer el apoyo técnico del Recurso Compartido de Microscopía Confocal y Especializada del Centro Oncológico Integral Herbert Irving de la Universidad de Columbia, financiado en parte a través de la Subvención del Centro de los NIH (P30CA013696). Este trabajo cuenta con el apoyo de los NIH (R21NS133635, Y.-H.L.; UH3TR002151, K. W. L.). La Figura 1A se creó utilizando BioRender.

Materials

2-Mercaptoethanol (1000x) Gibco 21985023
Accutase Sigma-Aldrich A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Research Labs 711-546-152 reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)  Jackson Immuno Research Labs 705-606-147 reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x) Gibco 12587010 thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4 ProSpec CYT-081 reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody  abcam ab28364 dilution ratio: 1:400
Centrifuge Eppendorf 022626001
CHIR99021 Tocris Bioscience 4423/10 make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1 Tocris 7163/10 make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I  Corning 40236
Confocal Microscope Nikon AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates Corning 4441
Countess II FL automated cell counter Thermo Fisher AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Gibco 10565018
DMEM/F-12, powder Gibco 12500062 make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A Cedars Sinai
Emricasan Medchemexpress LLC HY1039610MG make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody Cell Singali Technology 97249 dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum – Premium Atlanta Biologicals S11150 thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2 ProSpec CYT557 reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish World Precision Instruments FD35-100
Forskolin Tocris Bioscience 1099 reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL) Gibco 15710064
GlutaMAX supplement (100x) Gibco 35050061
Heparin, 100 kU MilliporeSigma 375095100KU reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Incubator Thermo Scientific 13998123
Knockout Serum Replacement Gibco 10828028 thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix Corning 356230 thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x) Gibco 11140050
Molecular Biology Grade Water Corning 46000CV
mTeSR plus kit STEMCELL Technologies 1001130 thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x) Gibco 17502048 thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M) Cytiva HyClone SH31088.01
NeuroBasal medium Gibco 21103049
NIS-Elements, ver 5.42 Nikon
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research Labs 17000121 reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713S dilute with PBS
PBST, 20x Thermofisher 28352
PDGFRβ antibody R&D AF385 dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x) Sigma-Aldrich P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49 SUNJIN LAB RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%) Gibco 25080094
Sodium deoxycholate monohydrate Thermofisher J6228822 dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x Thermofisher 28360
trans-ISRIB Tocris Bioscience 5284/10 make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher 15250061
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949-100ML
VEGF-A ProSpec CYT-116 reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C

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