Los estudios bioenergéticos y metabolómicos de las mitocondrias han revelado su papel multifacético en muchas enfermedades, pero los métodos de aislamiento de estos orgánulos varían. El método detallado aquí es capaz de purificar mitocondrias de alta calidad a partir de múltiples fuentes de tejidos. La calidad se determina mediante las proporciones de control respiratorio y otras métricas evaluadas con respirometría de alta resolución.
El aislamiento mitocondrial se ha practicado durante décadas, siguiendo los procedimientos establecidos por pioneros en los campos de la biología molecular y la bioquímica para estudiar las deficiencias metabólicas y las enfermedades. Es necesaria una calidad mitocondrial constante para investigar adecuadamente la fisiología mitocondrial y la bioenergética; Sin embargo, hay muchos métodos de aislamiento diferentes publicados disponibles para los investigadores. Aunque las diferentes estrategias experimentales requieren diferentes métodos de aislamiento, los principios y procedimientos básicos son similares. Este protocolo detalla un método capaz de extraer mitocondrias bien acopladas de una variedad de fuentes de tejidos, incluidos animales pequeños y células. Los pasos descritos incluyen la disección de órganos, la purificación mitocondrial, la cuantificación de proteínas y varios controles de calidad. La principal métrica de control de calidad utilizada para identificar mitocondrias de alta calidad es el índice de control respiratorio (RCR). El RCR es la relación entre la frecuencia respiratoria durante la fosforilación oxidativa y la tasa en ausencia de ADP. Se discuten métricas alternativas. Si bien con este protocolo se obtienen valores altos de RCR en relación con su fuente de tejido, se pueden optimizar varios pasos para satisfacer las necesidades individuales de los investigadores. Este procedimiento es robusto y ha dado lugar sistemáticamente a mitocondrias aisladas con valores de RCR superiores a la media en modelos animales y fuentes de tejidos.
Las mitocondrias son orgánulos subcelulares que establecen condiciones energéticas citoplasmáticas optimizadas para funciones celulares específicas. Si bien los estudios a nivel celular, de tejidos y de organismos pueden proporcionar información sobre la función mitocondrial, el aislamiento de los orgánulos ofrece un nivel de control experimental que no sería posible de otra manera. Los aislamientos mitocondriales se han realizado desde la década de 1940, lo que permite estudios mecanicistas del metabolismo y la respiración en una variedad de células y tejidos 1,2. La relevancia histórica de las mitocondrias también está bien documentada3. Como principales productoras de ATP, las mitocondrias desempeñan muchas funciones clave que son vitales para el funcionamiento óptimo de las células y losórganos. Dentro de la matriz mitocondrial, los sustratos son oxidados por el ciclo del TCA, produciendo equivalentes reductores y portadores de electrones móviles como NADH y UQH2 5,6. El citocromo C es el tercer principal portador móvil de electrones en la red de reacciones bioquímicas mitocondriales7. Estas moléculas son luego oxidadas por los complejos transmembrana del sistema de transporte de electrones (ETS) incrustados en la membrana mitocondrial interna8. Las reacciones redox del ETS se acoplan con la translocación de protones de la matriz al espacio intermembrana. Estos procesos establecen un gradiente electroquímico de protones que se utiliza para fosforilar ADP con Pi por F1F0 ATP sintasa para producir ATP 9,10. Los procesos individuales que ocurren en cada complejo pueden ser explorados con respirometría de alta resolución utilizando electrodos tipo Clark o ensayos de consumo de oxígeno en microplacas11,12. Además, los modelos de enfermedad y los tratamientos que utilizan mitocondrias aisladas pueden determinar el impacto o la importancia de la función mitocondrial en la progresión de ciertas patologías. Esto ha demostrado ser fructífero en el campo de la cardiología, donde las alteraciones en el suministro de combustible y sustrato se han utilizado para dilucidar cómo la disfunción mitocondrial influye en la insuficiencia cardíaca 13,14,15,16. También se sabe que las mitocondrias influyen en el desarrollo de otras enfermedades como la diabetes, el cáncer, la obesidad, los trastornos neurológicos y las miopatías17,18. Por lo tanto, el uso de mitocondrias aisladas o purificadas permite investigaciones mecanicistas del metabolismo oxidativo y la producción de ATP en el tejido fuente.
No faltan protocolos de aislamiento mitocondrial debido a su importancia en la investigación bioenergética. Además, se pueden encontrar métodos altamente específicos adaptados a subpoblaciones de mitocondrias dentro de tejidos y células 19,20. Los pasos básicos del procedimiento son similares entre los métodos de aislamiento, pero se pueden hacer variaciones para la composición del tampón, los pasos de homogeneización y los espines de centrifugación para mejorar la cantidad y la calidad de las mitocondrias. Los cambios en estos aspectos se basan en la demanda metabólica del tejido, la función general del órgano, la densidad mitocondrial y otros factores. En tejidos como el hígado y el músculo esquelético, se utilizan homogeneizadores portátiles para preservar la integridad mitocondrial y limitar el daño a las membranas mitocondriales21. Sin embargo, cuando se aísla de los riñones, algunos protocolos sugieren el uso de homogeneización manual o kits comerciales para obtener mejores resultados22. Aunque ambos métodos producen mitocondrias funcionales, la calidad de los orgánulos puede verse comprometida por el tiempo adicional que se tarda en completar los aislamientos utilizando estos protocolos. La centrifugación también es vital para la extracción de proteínas mitocondriales, ya que separa los componentes celulares como los núcleos y otros orgánulos de las mitocondrias23. Durante el proceso de aislamiento, se debate si se debe implementar la centrifugación diferencial o basada en la densidad para obtener aislados más puros24. Si bien la centrifugación por densidad puede separar las mitocondrias de orgánulos de gravedad específica similar, como los peroxisomas, no está bien establecido si las mitocondrias de estos métodos representan mejor la función de los orgánulos in situ en comparación con las mitocondrias aisladas mediante centrifugación diferencial. En el campo de la fisiología mitocondrial, se prefiere la centrifugación basada en la densidad y puede modificarse fácilmente para aumentar la pureza del aislado. Antes de la experimentación, se debe considerar si se incorporan cambios en las fuerzas g, la duración de la centrifugación y el número de espines de centrifugación debido a su influencia en la purificación mitocondrial. Además, la resuspensión mitocondrial, posiblemente el paso más crucial durante el aislamiento, difiere mucho entre los estudios, con el uso de raspado, mezcla basada en vórtice u homogeneización 23,25,26. La resuspensión mecánica de estos tipos puede ser demasiado abrasiva y perjudicar la integridad de la membrana de las mitocondrias. Por esta razón, se debe realizar un lavado suave para corregir esto. A pesar de la gran cantidad de modulaciones y metodologías sugeridas, hay menos protocolos completos con alta reproducibilidad y adaptabilidad para modelos de roedores.
Los métodos descritos en este documento describen un protocolo detallado, robusto y altamente reproducible que produce mitocondrias purificadas y bien acopladas a partir de tejido cardíaco de animales pequeños. Como se ha demostrado, este método se puede adaptar fácilmente para adaptarse a las necesidades específicas de cada experimento y/o entorno de laboratorio para aislar mitocondrias de riñones, hígado y células cultivadas. Se pueden hacer modificaciones adicionales para aislar las mitocondrias de los tejidos y otros animales que no se enumeran aquí. Se proporcionan recetas de tampón utilizadas para todos los aislamientos y se pueden modificar si es necesario. Al igual que otros protocolos publicados, se implementan la homogeneización motorizada y la centrifugación diferencial; Sin embargo, se realizan ajustes tanto en el tiempo de cizallamiento como en la fuerza a la que se centrifugan las muestras para proporcionar sistemáticamente aislados mitocondriales de alta calidad, dependiendo de la fuente de aislamiento. En particular, este protocolo difiere de otros por el uso de un lavado suave mediante pipeteo para resuspender las mitocondrias granuladas, lo que ayuda a preservar la integridad de la membrana mitocondrial y a mantener la funcionalidad general de los orgánulos. La proteína mitocondrial se cuantifica mediante la determinación de la proteína total o mediante la medición de la actividad de la citrato sintasa. La utilidad y la amplia aplicabilidad de este método de aislamiento están respaldadas por los valores de las proporciones de control respiratorio (RCR) logradas en varios organismos y fuentes de tejidos.
El cumplimiento de los métodos descritos de manera concisa en este protocolo asegurará el aislamiento de las mitocondrias bien acopladas del tejido cardíaco de pequeños roedores, además de otros tipos de tejidos y fuentes. En general, el proceso debe durar un total de 3-3,5 h, durante las cuales todos los tejidos, muestras y aislados animales deben permanecer en hielo a 4 °C tanto como sea posible para limitar la degradación. Este procedimiento es robusto y puede modificarse de va…
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a Daniel A. Beard y Kalyan C. Vinnakota por sus contribuciones fundamentales a este protocolo. Este trabajo fue financiado por la subvención NSF CAREER MCB-2237117.
1.7 mL microcentrifuge tubes | |||
10 mL glass beaker | For organ disection and mincing | ||
50 mL centrifuge tubes | Centrifugation | ||
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma | A5285 | Respirometry assays |
BSA Protein Assay Kit | Thermo Scentific | PI23225 | Mitochondrial protein quantification |
Dextrose | Sigma | DX0145 | For buffer (CB) |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma | E4378 | For buffers (CB and IB) and respirometry assays |
Glass cannula | Radnoti | Guinea pig and rat heart perfusion | |
Heparin sodium porcine mucosa | Sigma | SRE0027-250KU | Animal IP injection |
High-resolution respirometer | Clark-type electrode; oxygraph with 2 mL chambers | ||
Induction chamber | |||
Isoflurane | Sigma | 792632 | Anesthetic |
L-malic acid | Sigma | 02288-50G | Respirometry assays |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | For buffer (RB) |
Mannitol | Sigma | MX0214 | For buffer (IB) |
Microliter syringes | Sizes ranging from 5–50 µL | ||
Microplate reader | Must be able to incubate at 37 °C | ||
MOPS | Sigma | 475898 | For all buffers |
O2 tank | |||
OMNI THQ Homogenizer | OMNI International | 12-500 | Similar rotor stator homogenizers will work |
pipettes | Volumes of 2–20 µL; 20–200 µL; 200–1000 µL | ||
Potassium chloride | Sigma | P3911 | For buffers (RB and CB) |
Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | For buffers (IB and RB) |
Protease from Bacillus licheniformis | Sigma | P5459 | |
Sodium chloride | Sigma | S9888 | For buffer (CB) |
Sodium pyruvate | Fisher bioreagents | BP356-100 | Respirometry assays |
Sucrose | Sigma | 8510-OP | For buffer (IB) |
Surgical dissection kit | Depends on animal and tissue source | ||
Tabletop centrifuge | Must cool to 4 °C |