Summary

Métodos para tatuar Xenopus laevis con una máquina de tatuar rotativa

Published: June 28, 2024
doi:

Summary

Aquí, describimos métodos para tatuar Xenopus laevis adulto (rana africana con garras) con una máquina de tatuar rotativa. Un tatuaje adecuado da como resultado números oscuros y fácilmente legibles que duran varios meses y hacen que los animales se distingan fácilmente para fines de investigación y mantenimiento de registros.

Abstract

Los modelos animales amplían el alcance de la investigación biomédica, lo que mejora nuestra comprensión de la biología del desarrollo, molecular y celular y permite a los investigadores modelar enfermedades humanas. El registro y el seguimiento de animales individuales permite a los investigadores reducir el número de animales necesarios para el estudio y perfeccionar las prácticas para mejorar el bienestar animal. Existen varios métodos bien documentados para marcar y rastrear mamíferos, incluidos los puñetazos en las orejas y las marcas en las orejas. Sin embargo, los métodos para marcar las especies de anfibios acuáticos son limitados, ya que los recursos existentes son obsoletos, ineficaces o prohibitivamente costosos. En este manuscrito, describimos los métodos y las mejores prácticas para marcar Xenopus laevis con una máquina de tatuar rotativa. Un tatuaje adecuado da como resultado tatuajes de alta calidad, lo que hace que las personas sean fácilmente distinguibles para los investigadores y representan un riesgo mínimo para la salud de los animales. También destacamos las causas de los tatuajes de mala calidad, que pueden dar lugar a tatuajes que se desvanecen rápidamente y causan daños innecesarios a los animales. Este enfoque permite a los investigadores y veterinarios marcar a los anfibios, lo que les permite rastrear réplicas biológicas y líneas transgénicas y mantener registros precisos de la salud animal.

Introduction

Los modelos animales son herramientas útiles para investigar cuestiones relacionadas con la salud humana. En la práctica, la investigación biomédica con modelos animales requiere una organización y un mantenimiento cuidadosos de una colonia animal sana. Las mejores prácticas para el manejo y la cría éticos de animales tienen como objetivo reducir el número de animales necesarios para la experimentación y perfeccionar las prácticas para garantizar el bienestar animal1. El género de ranas con garras, incluyendo Xenopus laevis (X. laevis; Rana africana de garras) y Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Rana de uñas occidental), se han utilizado en la investigación biomédica desde la década de 1930, cuando los médicos sudafricanos utilizaron X. laevis para realizar las primeras pruebas de embarazo2. Si bien las pruebas de embarazo modernas ya no requieren ranas, el papel de la investigación sobre Xenopus persiste. Las ventajas de usar Xenopus para la investigación biomédica incluyen sus genomas bien anotados3, la ovulación inducible durante todo el año de grandes nidadas de huevos4 y huevos puestos externamente susceptibles de fertilización in vitro. Estas características los convierten en un activo útil para la embriología y el desarrollo de vertebrados 5,6,7, la biología molecular y celular básica 7,8,9,10 y para modelar enfermedades humanas 7,11,12,13.

Los métodos fiables para el seguimiento de animales individuales de Xenopus son esenciales para registrar las réplicas biológicas y mejorar el rigor y la reproducibilidad en la investigación. Dado que los Xenopus se alojan con frecuencia en grupos, el marcaje de animales permite a los investigadores rastrear fácilmentea los animales individuales. Mantener un registro preciso de los animales puede ahorrar tiempo y recursos y mejorar la capacidad de realizar un seguimiento de la salud de los animales. Por ejemplo, la identificación individual de animales puede mejorar los flujos de trabajo de organización para generar líneas de Xenopus transgénicos, ya que esto requiere múltiples generaciones de ranas con genotipos específicos verificados por secuenciación14, lo que requiere organización e identificación individual de animales. Esto es particularmente cierto cuando estas mutaciones carecen de fenotipos adultos fácilmente discernibles. Del mismo modo, el uso de ovocitos y embriones de Xenopus para estudiar la biología celular básica y del desarrollo se beneficia del seguimiento de animales individuales. Después de inducir la ovulación, los animales necesitan descansar durante un mínimo de 3 meses para prevenir complicaciones de salud como el síndrome de hiperovulación15. Los métodos de identificación individual garantizan que los animales no sean inducidos a ovular con demasiada frecuencia.

El marcado y el seguimiento de los animales también permiten al personal del laboratorio realizar un seguimiento de los problemas de salud de los animales. El hecho de que los animales del mismo genotipo enfermen puede indicar una endogamia excesiva o problemas de salud imprevistos asociados con el transgén. Del mismo modo, los animales que se enferman después de una ovulación reciente pueden indicar problemas con los reactivos, los materiales o las técnicas. El seguimiento de los animales y su salud permite al personal de laboratorio y a los veterinarios hacer un seguimiento cuando vuelven a surgir preocupaciones y tomar medidas preventivas para prevenir futuras enfermedades. En los mamíferos, existen numerosos métodos de identificación. Los métodos permanentes para ratones incluyen perforaciones en las orejas, marcas en las orejas, tatuajes y microchips subcutáneos16. Estos pueden diferenciar de manera clara y confiable a los animales dentro de una colonia o jaula y pueden ser administrados fácilmente por el personal del laboratorio. Métodos como el punzado de orejas son mínimamente invasivos, requieren solo una pieza de equipo especializado y funcionan para animales de la mayoría de las edades. Si bien estos sistemas son sencillos y útiles para los ratones, su uso en las ranas presenta un conjunto único de desafíos. Las ranas y otros anfibios carecen de pabellón auricular (estructura del oído externo). Algunos investigadores han colocado etiquetas en la mandíbula, el dedo del pie o la extremidad trasera del animal 17,18. Este enfoque dio lugar a varios problemas: las marcas en la mandíbula causaban irritación y las ranas agitadas intentaban arrancar las etiquetas con sus extremidades delanteras17. Las marcas de los dedos perforaban la membrana entre los dedos, lo que perjudicaba el movimiento y conllevaba el riesgo de perderse. Como tal, los anfibios requieren sus propios métodos para su identificación. Históricamente, el corte de los dedos de los pies también se ha utilizado para marcar anfibios17,19. El dedo del pie se corta con un par de tijeras afiladas, y el animal se puede identificar por la longitud de los dedos de las patas delanteras y traseras o por el ángulo en el que el dedo ha vuelto a crecer (en las salamandras). Sin embargo, este método plantea la preocupación ética de que el corte de los dedos de los pies pueda afectar el movimiento del animal17. Además, esto puede causar sangrado e introducir un riesgo de infección. Otro sistema de marcado establecido son los autoinjertos de piel, en los que se toma piel de una parte de la rana y se une quirúrgicamente a otra parte. Por ejemplo, se describe un método para marcar la espalda o el hombro de una rana utilizando un injerto de piel de color claro de su pecho20. Los injertos de piel también conllevan limitaciones y riesgos: el procedimiento es invasivo e introduce el riesgo de infección por Aeromonas hydrophila, o pata roja, una afección potencialmente mortal; La cicatrización completa del autoinjerto tarda hasta 6 semanas; Y con los métodos descritos, solo se pueden alojar 6 ranas juntas debido a que los lugares para colocar un autoinjerto son limitados20.

Los enfoques de marcado menos invasivos incluyen perlas de vidrio y chips de transpondedor17,19. En el método de cuentas de vidrio, las cuentas de vidrio se enhebran en una pequeña sutura y se cosen en la piel de la rana. Esto proporciona una mayor variabilidad que los autoinjertos de piel, con al menos 60 combinaciones de colores distintivas. Sin embargo, existe el riesgo de que la sutura se salga y se pierdan las cuentas. Alternativamente, se puede implantar un transpondedor de microchip debajo de la piel en el saco linfático dorsal de la rana. Este se considera el método de marcaje más permanente y permite identificar y catalogar individualmente un número potencialmente infinito de animales. Sin embargo, este es también el método más caro, ya que los microchips individuales son caros y sería costoso marcar una colonia grande. Los microchips también requieren un escáner especial para leer19. Un enfoque común para la identificación de Xenopus es referirse a la coloración y el patrón natural de los animales. Esto funciona especialmente bien para ranas como X. laevis, que tienen patrones distintos que permanecen durante toda la edad adulta. Sin embargo, estos patrones pueden cambiar con el tiempo con el estrés, y la coloración puede parecer diferente cuando las ranas se muevenentre contenedores transparentes y teñidos. Además, este método de identificación es menos útil para X. tropicalis, que tiene patrones de marca menos distintivos en comparación con X. laevis, o para los animales albinos, que no tienen marcas de color21. Incluso para especies con marcas distintas, el personal del laboratorio puede interpretar la ubicación y el tamaño de las marcas de manera diferente, lo que puede causar errores en la identificación. Debido a esto, fotografiar animales es más confiable junto con un método de identificación adicional. Por lo tanto, buscamos marcar e identificar a los animales Xenopus utilizando una técnica que sea fácilmente discernible, permanente y mínimamente invasiva.

Hay recursos publicados limitados que describen los métodos para tatuar anfibios. El tatuaje se ha descrito junto con otras técnicas de marca, incluidas las marcas de calor, las marcas de nitrato de plata y las marcas de congelación17. En el mismo recurso, el tatuaje se realizó dibujando números con una aguja hipodérmica de 27 G, y se observó que el proceso no causaba infección, en contraste con las otras técnicas de marcado, que usaban un alambre en forma de número u otra marca. En otra fuente, se utilizó una máquina de tatuar eléctrica (descrita como una aguja vibratoria) para marcar ranas, pero se proporcionaron pocos detalles sobre la técnica17,19. Los autores advierten que al perturbar la capa protectora de baba de la rana, este procedimiento aumenta el riesgo de patas rojas. Si bien no existe un método de marcado o identificación que sea completamente no invasivo (como las fotografías) y permanente (como los microchips), el tatuaje proporciona un compromiso efectivo. El tatuaje es relativamente sencillo en comparación con otras técnicas, como los autoinjertos de piel. Los beneficios adicionales incluyen una curva de aprendizaje más pequeña y un equipo relativamente económico. Tatuar anfibios acuáticos conlleva ciertos desafíos, que pueden intimidar a los investigadores y perjudicar el marcaje exitoso de los animales. Este artículo tiene como objetivo proporcionar a los investigadores métodos bien documentados para tatuar Xenopus adulto con una máquina de tatuar rotativa.

Protocol

Todos los procedimientos con animales descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Dartmouth College. 1. Configuración del equipo NOTA: Se incluye un flujo de trabajo para el procedimiento y un ejemplo de configuración del banco (Figura 1). Conecte la pistola de tatuaje y el pedal a la fuente de alimentación. Coloque el pedal debajo de la superficie de trabajo.</li…

Representative Results

Los tatuajes de alta calidad tendrán trazos oscuros y legibles en el pecho de la rana y se pueden diferenciar claramente a varios pies de distancia (Figura 5A). En general, los números y marcas más grandes son mejores para la legibilidad, pero los nombres y números más largos se pueden hacer más pequeños para que quepan cómodamente en el pecho de la rana. La longevidad de los tatuajes es más difícil de juzgar, pero los tatuajes de ranas de alta calidad deben permanecer oscuros y le…

Discussion

Tatuar humanos es una forma de arte que se remonta a miles de años, y durante el tiempo que los humanos se han tatuado a sí mismos, también han tatuado o marcado animales23. El equipo y las técnicas para marcar animales, en particular mamíferos, están bien establecidos, bien documentados y son ampliamente accesibles. Si bien el marcado de animales fue originalmente para distinguir el ganado y disuadir el robo23, su papel en la investigación biomédica se ha vuelto ig…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Centro de Medicina Comparativa e Investigación de Dartmouth College por proporcionar la cría diaria de los animales utilizados en este protocolo. También agradecemos a Leah Jacob y Adwaita Bose por su ayuda para probar el protocolo y fotografiar a los animales. Por último, agradecemos al laboratorio de Ann Miller por su formación en la práctica del tatuaje. Este trabajo fue apoyado por la subvención R00 de los NIH GM147826 a J.L.

Materials

3 needle round liners Worldwide Tattoo Supply 1203RLB Packaged sterile
5 Needle Round Disposable ULTRA Worldwide Tattoo Supply HTIPRS5-U Packaged sterile
5 needle round liners Worldwide Tattoo Supply 1205RLB Packaged sterile
7 needle round liners Worldwide Tattoo Supply 1207RLB Packaged sterile
Clip Cord Worldwide Tattoo Supply N/A
Foot pedal Worldwide Tattoo Supply N/A
Inkpots Worldwide Tattoo Supply N/A
Kimwipes, delicate task wipes Fisher Scientific 06-666A
RCA Connection Worldwide Tattoo Supply N/A
Scream Ink Pitch Black, 1oz Worldwide Tattoo Supply SI101
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
Stainless steel grips Worldwide Tattoo Supply N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Worldwide Tattoo Supply N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set Worldwide Tattoo Supply STEALTH2-SET
Styrofoam island N/A N/A This is the lid of a styrofoam cold shipping container
Tricaine (ethyl 3-aminobenzonate methanesulfate) Sigma-Aldrich E10521 CAUTION: IRRITANT
Unbleached paper towels Grainger 2U229 Paper towels MUST be unbleached, bleach is toxic to amphibians
Voltage Supply Worldwide Tattoo Supply N/A
Wash bottle (with frog-safe water) Fisher Scientific FB0340923T Frog safe water is dechlorinated, pH 7.0-8.5, conductivity 1200-1800 uS
X. laevis adult female Xenopus1 N/A
Zip-top plastic bag N/A N/A This bag should be large enough to hold the styrofoam island

Referencias

  1. Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals (Basel). 9 (10), 754 (2019).
  2. Elkan, E. R. The Xenopus pregnancy test. British Med J. 2, 1253-1256 (1938).
  3. Vize, P. D., Zorn, A. M. Xenopus genomic data and browser resources. Dev Biol. 426 (2), 194-199 (2017).
  4. Sive, H. . Xenopus: A Laboratory Manual. , (2023).
  5. Borodinsky, L. N. Xenopus laevis as a model organism for the study of spinal cord formation, development, function and regeneration. Front Neural Circuits. 11, 90 (2017).
  6. Hoppler, S., Conlon, F. L. Xenopus: Experimental access to cardiovascular development, regeneration discovery, and cardiovascular heart-defect modeling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (6), a037200 (2020).
  7. Fisher, M., et al. Xenbase: key features and resources of the Xenopus model organism knowledgebase. Genética. 224 (1), iyad018 (2023).
  8. Slater, P. G., Hayrapetian, L., Lowery, L. A. Xenopus laevis as a model system to study cytoskeletal dynamics during axon pathfinding. Genesis. 55 (1-2), (2017).
  9. Bermudez, J. G., Chen, H., Einstein, L. C., Good, M. C. Probing the biology of cell boundary conditions through confinement of Xenopus cell-free cytoplasmic extracts. Genesis. 55 (1-2), (2017).
  10. Stooke-Vaughan, G. A., Davidson, L. A., Woolner, S. Xenopus as a model for studies in mechanical stress and cell division. Genesis. 55 (1-2), (2017).
  11. Blackburn, A. T. M., Miller, R. K. Modeling congenital kidney diseases in Xenopus laevis. Dis Model Mech. 12 (4), dmm038604 (2019).
  12. Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Dev Biol. 426 (2), 325-335 (2017).
  13. Wheeler, G. N., Brändli, A. W. Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: Lessons from zebrafish and Xenopus. Dev Dyn. 236 (6), 1287-1308 (2009).
  14. Carron, M., et al. Evolutionary origin of Hox13-dependent skin appendages in amphibians. Nat Commun. 15 (1), 2328 (2024).
  15. Schultz, T. W., Dawson, D. A. Housing and husbandry of Xenopus for oocyte production. Lab Animal. 32 (2), 34-39 (2003).
  16. Cadillac, J. . Animal identification systems used for mice. , (2006).
  17. Donnelly, M. A., Guyer, C., Juterbock, J. E., Alford, R. A. Techniques for marking amphibians. Meas Monitor Biol Div: Std Meth Amphibians. , 277-284 (1994).
  18. Hutchens, S. J., Deperno, C. S., Matthews, C. E., Pollock, K. H., Woodward, D. K. Visible implant fluorescent marker: A reliable marking alternative for snakes. Herpetol Rev. 39 (3), 301-303 (2008).
  19. Hoogstraten-Miller, S., Dunham, D. Practical identification methods for African clawed frogs (Xenopus laevis). Lab Animal. 26 (7), 36-38 (1997).
  20. Loopstra, J. A., Zwart, P., Verhoeff-de Fremery, R., Vervoordeldonk, F. J. M. Marking of African clawed toads (Xenopus laevis). Improvement of a skin autograft technique. New Dev Biosci: Their Implicat Lab Animal Sci. , 311-316 (1988).
  21. Rödel, M. Xenopus tropicalis. AmphibiaWeb. , (2001).
  22. . Worldwide Tattoo Supply. Stealth 2 Rotary Tattoo Machine Intro & Maintenance. , (2015).
  23. Khan, S. U., Mufti, O. The hot history and cold future of brands. J Manager Sci. 1 (1), 75-84 (2007).
  24. Catlett, T. . All About Lip Tattoo: what to Expect, Cost, Risks, Touch-ups & More. , (2019).

Play Video

Citar este artículo
Suber, J. R., Landino, J. Methods for Tattooing Xenopus laevis with a Rotary Tattoo Machine. J. Vis. Exp. (208), e67086, doi:10.3791/67086 (2024).

View Video