Presentamos un novedoso dispositivo para medir las tasas de consumo de oxígeno (OCR) en cultivos epiteliales de pigmento de retina (EPR). El dispositivo puede medir el OCR durante semanas seguidas en RPE cultivado en placas de cultivo celular estándar con medios estándar mientras las placas están en una incubadora de cultivo celular estándar.
El metabolismo mitocondrial es fundamental para el funcionamiento normal del epitelio pigmentario de la retina (EPR), una monocapa de células de la retina importante para la supervivencia de los fotorreceptores. La disfunción mitocondrial del EPR es una característica distintiva de la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la principal causa de ceguera irreversible en el mundo desarrollado, y de la vitreorretinopatía proliferativa (RVP), una complicación cegadora de los desprendimientos de retina. Las condiciones degenerativas del EPR han sido bien modeladas por sistemas de cultivo de EPR que están altamente diferenciados y polarizados para imitar el EPR in vivo . Sin embargo, el monitoreo de las tasas de consumo de oxígeno (OCR), un indicador de la función mitocondrial, ha sido difícil en dichos sistemas de cultivo porque las condiciones que promueven la polarización y diferenciación ideal del RPE no permiten mediciones fáciles de OCR.
Aquí, presentamos un sistema novedoso, Resipher, para monitorear OCR durante semanas a la vez en cultivos de EPR bien diferenciados mientras se mantiene el EPR en sustratos de crecimiento óptimos y medios de cultivo fisiológicos en una incubadora de cultivo celular estándar. Este sistema calcula el OCR midiendo el gradiente de concentración de oxígeno presente en los medios por encima de las células. Discutimos las ventajas de este sistema sobre otros métodos para detectar OCR y cómo configurar el sistema para medir OCR en cultivos de RPE. Cubrimos consejos y trucos clave para usar el sistema, precaución sobre la interpretación de los datos y pautas para solucionar problemas de resultados inesperados.
También proporcionamos una calculadora en línea para extrapolar el nivel de hipoxia, normoxia o hiperoxia que experimentan los cultivos de RPE en función del gradiente de oxígeno en los medios por encima de las células detectadas por el sistema. Finalmente, revisamos dos aplicaciones del sistema, midiendo el estado metabólico de las células EPR en un modelo de PVR y entendiendo cómo el EPR se adapta metabólicamente a la hipoxia. Anticipamos que el uso de este sistema en cultivos de EPR altamente polarizados y diferenciados mejorará nuestra comprensión del metabolismo mitocondrial del EPR, tanto en estados fisiológicos como de enfermedad.
El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa de células epiteliales funcionalmente postmitóticas altamente polarizadas que forman una barrera entre los fotorreceptores sensibles a la luz en la retina y su circulación sanguínea, un lecho capilar denominado coriocapilar. Al igual que el papel de las neuronas de soporte de la glía, el EPR lleva a cabo innumerables funciones para apoyar a los fotorreceptores, incluida la fagocitosis de los segmentos externos de los fotorreceptores, el transporte de nutrientes y el apoyo metabólico de los fotorreceptores, y la secreción de factores de crecimiento esenciales, todos críticos para mantener la función visual.
La degeneración del EPR subyace a varios trastornos degenerativos comunes de la visión. En la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), una de las causas más comunes de pérdida de visión incurable en el mundo, el EPR muere y, por lo tanto, los fotorreceptores suprayacentes sufren una degeneración secundaria. En la vitreorretinopatía proliferativa (PVR), el EPR, en cambio, sale de su estado postmitótico normalmente inactivo, proliferando y desdiferenciándose en un estado mesenquimal (la llamada transición epitelial a mesenquimal [EMT]) con alteraciones en su metabolismo. La desdiferenciación del EPR provoca una pérdida del apoyo del EPR a los fotorreceptores, al tiempo que desencadena un estado más fibrótico. Esto da lugar tanto a la degeneración de los fotorreceptores como a la cicatrización inducida por el EPR, que desencadenan la pérdida de la visión 1,2.
Una parte importante del apoyo del EPR a los fotorreceptores es metabólica, y la desregulación metabólica es un factor crítico en numerosas enfermedades de la retina, incluidas la DMAE y la RVP. El EPR sirve como barrera reguladora entre los fotorreceptores y su fuente de oxígeno y nutrientes, la coriocapilar. Por lo tanto, lo que el EPR elige metabolizar frente a lo que el EPR elige pasar de la coriocapilar a los fotorreceptores gobierna en gran medida el metabolismo y la supervivencia de los fotorreceptores. Numerosos estudios han demostrado que el EPR depende en gran medida del metabolismo mitocondrial para su salud normal, y que los fotorreceptores dependen en gran medida de la glucólisis3. Esto ha introducido el concepto de estados metabólicos complementarios y entrelazados entre los fotorreceptores y el EPR. Específicamente, el EPR reduce su metabolismo de los sustratos metabólicos fotorreceptores preferidos y, en su lugar, utiliza los subproductos del metabolismo de los fotorreceptores combinados con los metabolitos que los fotorreceptores no consumen. En enfermedades como la RVP y la DMAE, la evidencia sugiere fuertemente que el EPR se vuelve más glucolítico y menos dependiente del metabolismo mitocondrial; este cambio hacia la glucólisis RPE puede privar a los fotorreceptores de los metabolitos que necesitan, desencadenando la degeneración 4,5,6. Dado lo interdependientes que son el metabolismo del EPR y los fotorreceptores y el grado de alteración del metabolismo que subyace a la enfermedad de la retina, existe un gran interés en modelar y manipular el metabolismo del EPR con fines terapéuticos.
Si bien el estudio del metabolismo mitocondrial del EPR in vivo es ideal, muchos aspectos del metabolismo mitocondrial del EPR solo se pueden investigar prácticamente en un sistema de cultivo in vitro. En las últimas décadas se han realizado avances significativos hacia los cultivos de EPR de alta fidelidad, hasta el punto de que los cultivos de EPR más cuidadosamente preparados se utilizan ahora para la terapia de reemplazo celular en ensayos clínicos en humanos7. Para mantener estos cultivos de alta fidelidad, el EPR debe cultivarse en sustratos particulares en medios particulares durante meses antes de la experimentación. Con estas condiciones, los cultivos de EPR se diferencian y polarizan al máximo, aproximándose al EPR in vivo. Desafortunadamente, actualmente no hay ningún equipo disponible que pueda medir el metabolismo mitocondrial específicamente a partir del RPE in vivo. Si bien la monitorización del oxígeno de la red capilar de la retina se ha logrado in vivo utilizando oximetría de resonancia paramagnética electrónica (EPR)8, esto no es posible para el análisis de RPE. Las diferencias entre el metabolismo del EPR in vivo e in vitro no están bien descritas, pero se ha demostrado que los cultivos de EPR tienen una alta actividad mitocondrial, similar al EPR in vivo 3,9, lo que sugiere que se puede obtener información significativa sobre el metabolismo mitocondrial del EPR utilizando cultivos de EPR de alta fidelidad.
Dado que todo metabolismo mitocondrial conduce al consumo de oxígeno, la medición de las tasas de consumo de oxígeno (OCR) del EPR es un indicador fiel del metabolismo mitocondrial. La medición del OCR en cultivos de EPR ha sido difícil, ya que las condiciones que promueven la máxima polarización y diferenciación del EPR a menudo impiden mediciones precisas de OCR a largo plazo con las técnicas disponibles actualmente, como el analizador de caballitos de mar. En este documento de métodos, se presenta un dispositivo novedoso, denominado Resipher (en lo sucesivo denominado “el sistema”), que permite la medición continua de OCR durante semanas en RPE cultivado en condiciones que promueven al máximo la polarización y la diferenciación. La facilidad con la que este sistema puede medir el OCR en condiciones de cultivo de RPE que promueven al máximo la diferenciación y polarización del RPE es única entre los dispositivos de medición de OCR existentes.
Este documento proporciona consejos y trucos para usar el sistema con cultivos RPE, seguido de una demostración de dos aplicaciones particulares. En primer lugar, la EMT RPE, que imita la PVR, se desencadena por la exposición al factor de crecimiento transformante beta (TGFβ)1,10,11,12. El sistema se utiliza para monitorizar cómo evoluciona el metabolismo del RPE durante el proceso de EMT. En segundo lugar, se explora el papel de la hipoxia en el metabolismo del EPR utilizando este sistema. La hipoxia es un contribuyente importante a la patogénesis de la DMAE, ya que la coriocapilar se adelgaza con la edad13,14. La combinación de este sistema con cámaras de hipoxia permite modelar el metabolismo mitocondrial alterado del EPR con la sutil hipoxia que acompaña al envejecimiento. Por último, se presenta una calculadora en línea que utiliza datos de Resipher para permitir determinar si los cultivos de EPR se encuentran en condiciones hipóxicas, normóxicas o hiperóxicas. Esta información es fundamental para sacar conclusiones sobre el metabolismo del EPR a partir de estudios de cultivo in vitro de EPR.
El metabolismo mitocondrial del EPR desempeña un papel fundamental en la patogénesis de las enfermedades comunes de la retina que causan ceguera, como la DMAE y la RVP. El modelado del metabolismo mitocondrial del EPR in vitro permite aislar su estado metabólico del de los tejidos circundantes, además de someter al tejido a diferentes agresiones que simulan la enfermedad de forma controlada. Este modelado in vitro del metabolismo mitocondrial del EPR se ha visto facilitado por el advenimiento de cul…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a los Dres. Daniel Hass y Jim Hurley por la idea de probar la solubilidad delO2 en medios nuevos frente a medios condicionados como control. Agradecemos a la Dra. Magali Saint-Geniez por su aporte editorial sobre el manuscrito. Agradecemos a Scott Szalay de Instrument and Electronic Services Core, Kellogg Eye Center, por adaptar la cámara de hipoxia con el cable USB Resipher. No se utilizaron fondos federales para la investigación de HFT. El Núcleo de Servicios Electrónicos cuenta con el apoyo de la EY007003 P30 del Instituto Nacional del Ojo. Este trabajo cuenta con el apoyo de una subvención departamental sin restricciones de Investigación para Prevenir la Ceguera (RPB). J.M.L.M. cuenta con el apoyo de la Iniciativa James Grosfeld para la Degeneración Macular Relacionada con la Edad Seca, la Fundación E. Matilda Ziegler para Ciegos, una subvención del banco de ojos Eversight, una subvención K08EY033420 del Instituto Nacional del Ojo y el apoyo de Dee y Dickson Brown, así como de la Fundación David y Lisa Drews Discovering Hope. D.Y.S. cuenta con el apoyo del Programa Scientia de la UNSW. L.A.K. cuenta con el apoyo del Premio Iraty, Monte J. Wallace, Michel Plantevin, una beca R01EY027739 del Instituto Nacional del Ojo y el VR220059 de Actividad de Adquisición de Investigación Médica del Ejército del Departamento de Defensa.
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | #25-200-056 | |
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma | T5516 | |
32-channel Resipher lid | Lucid Scientific | NS32-101A for Falcon | |
Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma | A8674-25MG | Inhibitor of Complex III of the electron transport chain |
BAM15 | Sigma | SML1760-5MG | Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration |
DMSO, cell culture grade | Sigma-aldrich | D4540-100ML | Vehicle for reconstituting mitochondrial drugs |
Extracellular matrix coating substrates: Synthemax II-SC |
Corning | #3535 | Extracellular matrix for hfRPE |
Extracellular matrix coating substrates: Vitronectin | Gibco | A14700 | Extracellular matrix for iPSC-RPE |
FCCP | Sigma | C2920-10MG | Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration |
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H) | Bio-Techne | S11550H | |
Hydrocortisone-Cyclodextrin | Sigma | H0396 | |
Hypoxia chamber | Embrient Inc. | MIC-101 | |
N1 Media Supplement | Sigma | N6530 | |
Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
O2 sensor | Sensit technology or Forensics Detectors | P100 or FD-90A-O2 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Recombinant human TGFβ2 | Peprotech | 100-35B | Transforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition |
Rotenone | Sigma | R8875-1G | Inhibitor of Complex I of the electron transport chain |
System-compatible plate | Corning | #353072 | |
Taurine | Sigma | T8691 | |
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media) | Corning | 15-012-CV |
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