JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Достижения в технологии производства органоидов крупного рогатого скота с использованием монослойных интерфейсов тонкого и толстого кишечника

Published: June 14, 2024
doi:
10.3791/67010
, ,
1Department of Veterinary Microbiology and Pathology, College of Veterinary Medicine,Washington State University, 2Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine,Washington State University

Summary

В этом исследовании представлен протокол создания 2D-монослоев кишечника крупного рогатого скота из органоидов, обеспечивающий улучшенный доступ к изучению взаимодействий хозяина и патогена. Он включает в себя методы оценки целостности и функциональности мембраны, усовершенствование моделей in vitro , которые имитируют физиологию желудочно-кишечного тракта крупного рогатого скота. Такой подход обещает значительные биомедицинские и сельскохозяйственные преимущества, в том числе усовершенствованные стратегии лечения.

Abstract

Углубление знаний о физиологии желудочно-кишечного тракта и его заболеваниях в решающей степени зависит от разработки точных, видоспецифичных моделей in vitro , которые точно имитируют ткани кишечника in vivo . Это особенно важно для исследования взаимодействий хозяина и патогена у крупного рогатого скота, который является значительным резервуаром для патогенов, представляющих серьезную опасность для здоровья населения. Традиционные 3D-органоиды обеспечивают ограниченный доступ к апикальной поверхности кишечного эпителия, что является препятствием, преодоленным с появлением 2D-монослойных культур. Эти культуры, полученные из органоидных клеток, обеспечивают открытую поверхность просвета для более доступного изучения. В данном исследовании представлен подробный протокол создания и поддержания 2D монослойных культур из клеток органоидов тонкого и толстого кишечника крупного рогатого скота. Этот метод включает в себя протоколы оценки целостности мембраны через трансэпителиальное электрическое сопротивление и парацеллюлярную проницаемость, а также методы иммуноцитохимического окрашивания. Эти протоколы закладывают основу для создания и определения характеристик двухмерной монослойной системы культивирования крупного рогатого скота, расширяя границы применения этих методов в биомедицинских и трансляционных исследованиях, имеющих значение для общественного здравоохранения. Использование этого инновационного подхода позволяет разрабатывать физиологически релевантные модели in vitro для изучения как нормальных, так и болезненных состояний физиологии кишечника крупного рогатого скота. Последствия для биомедицинских и сельскохозяйственных достижений имеют глубокие последствия, прокладывая путь к более эффективному лечению кишечных заболеваний у крупного рогатого скота, тем самым улучшая как благополучие животных, так и безопасность пищевых продуктов.

Introduction

Культивирование эпителиальных стволовых клеток кишечника в трехмерных (3D) культурах, известных как кишечные органоиды, знаменует собой значительный прогресс в технологии in vitro для исследования функций кишечника, питания и взаимодействия с патогенами 1,2. Эти органоиды имитируют сложную структуру кишечного эпителия in vivo, самовоспроизводясь и организуясь в трехмерные образования, которые охватывают различные линии кишечныхклеток. Эта особенность подчеркивает их значительный потенциал для продвижения вперед в понимании биологии кишечника.

Растущий интерес к применению технологии кишечных органоидов к сельскохозяйственным животным требует совершенствования методов культивирования и поддержания 4,5. Актуальность данной технологии подчеркивается ее потенциальным влиянием на изучение здоровья кишечника сельскохозяйственных животных, которое играет решающую роль в их продуктивности и, следовательно, в экономике пищевой животноводческой промышленности, влияя на благополучие животных и эксплуатационные расходы 6,7. В частности, использование кишечных органоидных культур для изучения функции кишечника крупного рогатого скота имеет первостепенное значение, учитывая их роль в качестве резервуаров для зоонозных кишечных патогенов, таких как Salmonella spp. и Escherichia coli (E. coli) O157:H78. Эти патогены локализованы в определенных сегментах кишечника, что делает необходимым дифференцирование методов культивирования кишечных органоидов по сегментам кишечника для повышения точности исследований9.

Существенным препятствием в изучении кишечных органоидов является ограниченный доступ к апикальной поверхности эпителиальных клеток10. При культивировании во внеклеточном матриксе (ВКМ) клетки естественным образом ориентируются таким образом, что базальная поверхность обращена наружу, а апикальная поверхность направлена внутрь10. Для решения этой проблемы были представлены методы, которые включают диссоциацию 3D-органоидов в одиночные клетки и их засеивание в полупроницаемые вставки клеточных культур. Эта установка устанавливает границу между апикальной поверхностью и базолатеральным компартментом. Этот протокол демонстрирует, что клетки, полученные из кишечных органоидов крупного рогатого скота, могут образовывать когерентный двумерный монослой, о чем свидетельствуют измерения трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) и анализы парацеллюлярной проницаемости. Кроме того, развитие клеточной полярности с щеточными границами и плотными соединениями в двумерных монослойных клетках, полученных из органоидов, подтверждается с помощью иммунофлуоресценции и электронной микроскопии, что отражает свойства кишечного эпителия in vivo .

В этом исследовании подвздошная кишка представляет тонкий кишечный тракт, а прямая кишка — толстый кишечный тракт. Этот выбор основан на соответствующих кишечных патогенах, таких как Salmonella spp., которая может транслоцировать подвздошную кишку11, и E. coli O157:H7, которая, как известно, в первую очередь колонизирует прямую кишку9 у крупного рогатого скота. Выбор этих специфических сегментов кишечника подчеркивает необходимость адаптации методов культивирования кишечных органоидов к области кишечника для обеспечения точности исследований. Эти методы подробно описывают процедуру эффективного культивирования полученного из органоидов 2D-монослоя из этих сегментов кишечника, обеспечивая надежную модель для изучения здоровья кишечника крупного рогатого скота, патогенных инфекций и взаимодействий между микробиомом кишечника и хозяином.

Protocol

Кишечные крипты были получены из избыточных образцов кишечника, полученных на местной скотобойне, а сигнализация о донорах представлена в дополнительной таблице 1. Органоиды были получены с использованием тканей, полученных от животных, которые были гуманно усыплены на скотобойне, и животные не были закуплены исключительно для этих исследований; Таким образом, данное исследование не подлежит рассмотрению IACUC, и заявление об этике не применяется. 1. Покрытие ECM на вставках клеточных культур для 2D-монослойных культур на основе органоидов ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры проводятся с использованием стерилизованных материалов и асептических методов в шкафу биобезопасности. Если не указано иное, все реагенты находятся на льду на протяжении всей процедуры. Приготовьте 100 мкл ЭКМ для покрытия каждой вкладыша клеточной культуры размером 0,33см2 , тщательно перемешав базальную среду с 2% (v/v) гидрогелем на основе ЭКМ в микропробирке. Извлеките отдельный вкладыш для клеточной культуры из упаковки стерилизованными щипцами и поместите по отдельности в лунки 24-луночного планшета для культивирования клеток с плоским дном. Нанесите 100 мкл покрытия ECM, приготовленного на шаге 1.1, на апикальную камеру каждой вставки для клеточной культуры, приготовленной на шаге 1.2. Установите на место крышку и инкубируйте планшет для клеточной культуры, содержащий вставку (вставки) для клеточных культур с покрытием, в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C и 5%CO2 в течение 1 ч.Для органоидных клеток подвздошной кишки вкладыш готов к использованию после 1 ч инкубации. Для ректальных органоидных клеток после 1-часовой инкубации покрытие ECM заменить ректальной монослойной питательной средой и инкубировать в течение ночи (Таблица 1). Подготовьте дополнительные вставки для клеточных культур для пустого контроля, если они предназначены для выполнения измерений TEER. Подвздошная кишка Прямая кишка Время инкубации покрытия ECM 1 ч 1 ч, за которым следуетночь в однослойных питательных средах Добавки корганоидная питательная среда CHIR99021 LY2157299 LY2157299 У-27632 У-27632 Фетальная бычья сыворотка Фетальная бычья сыворотка Плотность засева клеток (ячейки/лунка) 5 х 105 3 х 105 Таблица 1: Резюме оптимизированного протокола для создания 2D-монослоев, полученных из органоидов подвздошной кишки и прямой кишки крупного рогатого скота. 2. Посев органоидных клеток подвздошной кишки и/или прямой кишки крупного рогатого скота и 2D-монослойная культура ПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе, описанном в этом разделе, используются бычьи подвздошные и ректальные органоиды, которые были культивированы и поддерживались на 48-луночных планшетах с использованием описанных методов5. Для достижения оптимальных результатов рекомендуется использовать стабильно поддерживаемые органоиды, которые были пассированы более 3 раз после первоначального пассажа и культивировались более 3 дней после последнего пассажа. Не нарушая гидрогелевый купол на основе ЭХМ, содержащий зрелые органоиды, удалите органоидные питательные среды с помощью одноразовой стеклянной пипетки Пастера, прикрепленной к вакуумной системе, и добавьте 300 мкл ледяного раствора для деполимеризации ЭХМ на лунку. Выдерживать не менее 1 ч при температуре 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно механически разрушить органоид, содержащий гидрогелевый купол на основе ECM, после добавления раствора для деполимеризации ECM и собрать суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл перед инкубацией при 4 °C. Этот метод рекомендуется, когда органоиды, которые не предназначены для использования для 2D монослойной культуры, культивируются одновременно на одной и той же пластине. Плотность органоидных культур существенно влияет на количество необходимых лунок для органоидных культур для оптимального засева во вставки клеточных культур.Для органоидных культур высокой плотности (дополнительный рисунок 1A) во вкладышах ректальных клеточных культур используется коэффициент посева в диапазоне от 1:1 до 1:2, что означает, что одна культуральная лунка может засеять одну-две лунки. Для подвздошной кишки соотношением придерживайтесь 1:1. Напротив, культуры с более низкой плотностью (дополнительный рисунок 1B) требуют большего количества культуральных лунок; Используйте 3-4 лунки для культуры ректальных органоидов для одной вставки для культуры ректальных клеток (соотношение 3-4:1) и 4-5 лунок для культуры органоидов подвздошной кишки для одной вставки для культуры подвздошных клеток (соотношение 4-5:1). Визуально осмотрите на предмет полного растворения гидрогеля на основе ЭХМ и соберите органоидную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл. Гранулированные органоиды центрифугированием при 200 x g и 4 °C в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендировать гранулу в 1 мл раствора фермента диссоциации рекомбинантных клеток с добавлением 10 мкМ Y-27632. Органоидную суспензию инкубировать на водяной бане при температуре 37 °C в течение 10 мин с прерывистым встряхиванием по 3-5 с вихрем каждые 2-3 мин для обеспечения эффективной диссоциации органоидов. После ферментативного расщепления добавьте 5 мл базальной среды и агрессивно пипетируйте с помощью микропипетки P1000 для дальнейшего разрушения органоидов до отдельных клеток. Осмотрите суспензию на наличие органоидных комков и, если они все еще визуально заметны, повторите пипетирование для усиления диссоциации одиночных клеток. Приготовьте коническую пробирку объемом 50 мл с клеточным фильтром 70 мкм. Предварительно смочите ситечко, внеся 1-2 мл базальной среды. Фильтруйте суспензию ячейки через сетчатый фильтр для удаления остатков гидрогеля на основе ECM и крупных клеточных комков. Промойте исходную пробирку объемом 15 мл и клеточное ситечко 70 мкм еще 10 мл базальной среды.ПРИМЕЧАНИЕ: Если клеточная суспензия не проходит легко через сетчатое фильтрование, это может быть признаком неполной диссоциации органоидов. Можно попытаться повторно пропустить собранную клеточную суспензию через тот же 70 мкм клеточный фильтр. Может потребоваться дополнительное ферментативное или механическое нарушение. Гранулы суспензируют одноэлементными центрифугированием при температуре 200 x g и 4 °C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки с помощью соответствующего объема базальной среды для подсчета клеток. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра после окрашивания трипановым синим, чтобы рассчитать общее количество собранных клеток. Гранулы суспензируют одноэлементными центрифугированием при температуре 200 x g и 4 °C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки до соответствующей плотности посева в соответствующей монослойной питательной среде (табл. 1).Для органоидных клеток подвздошной кишки ресуспендировать клетки до концентрации 2,5 x 106 клеток/мл для достижения плотности посева 5 x 105 клеток на одну клеточную культуру вставить в 200 мкл монослойной питательной среды подвздошной кишки, которая представляет собой органоидную питательную среду с добавлением 500 нМ LY2157299, 10 мкМ Y-27632 и 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Для ректальных органоидных клеток ресуспендировать клетки до концентрации 1,5 x 106 клеток/мл для достижения плотности посева 3 x 105 клеток на вставку клеточной культуры в 200 мкл ректальной монослойной питательной среды, которая представляет собой органоидную питательную среду с добавлением 100 нМ CHIR99021, 500 нМ LY2157299, 10 мкМ Y-27632, и 20% FBS. Извлеките 24-луночный планшет для клеточной культуры с вкладышем (вставками) для клеточных культур с покрытием ECM и опорожните апикальную камеру вкладыша для клеточной культуры с помощью осторожного вакуумного всасывания, чтобы не нарушить покрытие. Аккуратно нанесите 200 мкл одноклеточной суспензии, приготовленной на шаге 2.10, в апикальную камеру вкладыша для клеточной культуры. Для контроля бланка добавьте 200 мкл питательных сред без клеток в апикальной камере. Для контроля бланка добавьте 200 мкл питательных сред без клеток в апикальной камере. Нанесите 500 мкл соответствующим образом дополненной монослойной питательной среды (в зависимости от клеток подвздошной кишки и прямой кишки) в базолатеральную камеру каждой лунки. Инкубируйте в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5%CO2 для облегчения адгезии и роста клеток с образованием сливающегося 2D-монослоя на вставке для клеточной культуры. Меняйте питательные среды в апикальной и базолатеральной камерах через день, начиная с 48 ч после посева клеток. Обеспечьте одинаковое время инкубации для контроля заготовки и вкладыша, содержащего клетки. 3. Измерение TEER ПРИМЕЧАНИЕ: В описанном здесь методе используется коммерчески доступная ручная система измерения TEER, известная как эпителиальный вольтометр с парой электродов Ag/AgCl (рис. 1A). Определение TEER на 2D-монопласте требует измерения глухих скважин. Убедитесь, что чистый считывание производится таким же образом, как и образец. Достаньте из инкубатора планшет с вкладышами для клеточных культур с 2D-монослоем(ами) органоидов и заготовкой. Дайте тарелке нагреться до комнатной температуры примерно на 10 минут. Продезинфицируйте электроды 70% этанолом и дайте им полностью высохнуть. Осторожно введите электроды с коротким концом в апикальную камеру и длинным концом в базолатеральную камеру (рис. 1А).ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо соблюдать особую осторожность, чтобы не нарушить монослой клетки. Дайте показаниям уравновеситься и запишите значение в Ом, когда оно стабилизируется.ПРИМЕЧАНИЕ: Чувствительность вольтомметра такова, что при измерении электрического сопротивления будут возникать колебания значения Ома. Надежные показания получаются, когда измерения стабилизируются и постоянно колеблются вокруг значения плато. Определите TEER 2D монослоя по следующей формуле:TEER (Ω xсм 2) = площадь поверхности вставок для клеточных культур (см2) x чистое электрическое сопротивлениеГде Чистое электрическое сопротивление равно измеренному сопротивлению однослойной вставки ячейки за вычетом измеренного сопротивления заготовки вставки. Вставки для клеточных культур для 24-луночных планшетов имеют площадь поверхности 0,33см2. Рисунок 1: Оценка целостности эпителиального барьера 2D-монослоя, полученного из органоидов кишечника крупного рогатого скота. (A) Схема соответствующего расположения электродов в апикальной и базолатеральной камерах вкладыша для клеточной культуры для измерений TEER. Короткий электрод вставляется в апикальную камеру, а длинный электрод помещается в базолатеральную камеру с осторожностью, чтобы избежать контакта с мембраной. (B) Схема процесса анализа проницаемости. Камеры для клеточных культур 2 раза промывают подогретым PBS, и в апикальную камеру наносят 0,5 мг/мл 4 кДа индикатора FITC-декстрана, растворенного в PBS. Повторные 50 мкл аликвот из базолатеральной камеры отбирают с заменой равного объема PBS для поддержания общего объема в базолатеральной камере на протяжении всего инкубационного периода. Интенсивность флуоресценции аликвоты измеряют с помощью считывателя микропланшетов для количественной оценки диффузии индикатора FITC-декстрана с массой 4 кДа по монослою клетки. (C) Динамическое развитие целостности барьера в подвздошных и ректальных монослоях с течением времени оценивали с помощью измерений TEER (представленных замкнутыми кругами для подвздошной кишки и замкнутыми квадратами для прямой кишки) и анализов проницаемости (обозначенных разомкнутыми кругами для подвздошной кишки и открытыми квадратами для прямой кишки) с помощью индикатора FITC-декстрана с массой 4 кДа. К 3-му дню культивирования оба типа монослоев продемонстрировали создание стабильных и функциональных эпителиальных барьеров, о чем свидетельствуют их соответствующие профили TEER и проницаемости. Результаты являются средним значением, по крайней мере, двух независимых экспериментов с двумя техническими повторами. Полосы погрешностей представляют собой SEM измерений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. 4. Анализ парацеллюлярной проницаемости ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ включает в себя определение интенсивности флуоресценции в результате диффузии флуоресцеина изотиоцианата (FITC)-декстрана из апикальной камеры в базолатеральную камеру через 2D-монослои в течение 120 минут (Рисунок 1B). Для получения оптимальных результатов рекомендуется свести к минимуму воздействие света во время анализа и проводить измерения в микропланшетном сканере сразу после каждого отбора проб, чтобы предотвратить любое снижение или затухание флуоресценции. Каждая лунка может быть использована только один раз и не может быть повторно использована в последующих анализах. Подготовьте не менее 2 лунок, которые будут служить техническими репликами для каждого анализа. Например, для получения результатов, представленных на рисунке 1C, требуется в общей сложности 6 лунок, где анализы проводились в двух экземплярах в 3 разных временных точках (1, 3 и 5 дни культивирования). Приготовьте стандартную серию разведения кривой с 4 кДа ФИТК-декстрана в фосфатно-солевом буфере (PBS). Для каждого разведения пипетку подавайте 50 л на 96-луночный планшет в трех экземплярах.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется создать серию из 5-7 разведений в диапазоне от 0 до 0,5 мг/мл. Определение интенсивности флуоресценции эталонов в предварительно откалиброванном считывателе микропланшетов с длиной волны возбуждения 495 нм и длиной волны излучения 535 нм. Рассчитайте линейную регрессию с результатами интенсивности флуоресценции для создания стандартной кривой. Достаньте из инкубатора планшет, содержащий вкладыши для клеточных культур с 2D-монослоем(ами), полученным из органоидов. Удалите монослойные питательные среды из апикальной и базолатеральной камеры вставки для клеточной культуры, содержащей оцениваемый 2D-монослой, полученный из органоидов. Аккуратно промойте каждую камеру 2 раза 200 мкл (апикальная камера) и 500 мкл (базолатеральная камера) предварительно подогретого PBS соответственно. Извлеките промывочный раствор из апикальной камеры и нанесите 200 мкл 0,5 мг/мл 4 кДа индикатора FITC-декстрана в PBS в апикальную камеру вставки для клеточной культуры. Инкубировать в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C и 5%CO2 в течение 20 минут. Образец 50 мкл из базолатеральной камеры инкубируемого 24-луночного планшета и перенос на 96-луночный планшет, совместимый с микропланшетом. Замените 50 мкл свежего PBS в базолатеральной камере отбираемой лунки. Немедленно измерьте интенсивность флуоресценции в предварительно откалиброванном считывателе микропланшетов на длине волны возбуждения 495 нм и длине волны излучения 535 нм. Повторяйте шаги 4.6-4.10 каждые 20 минут до 120 минут. В конце анализа, если желательно сохранение 2D монослоя, промойте как апикальную, так и базолатеральную камеру свежим PBS 2x, замените свежей монослойной питательной средой и инкубируйте.ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть выполнена дальнейшая оценка 2D монослоев, т.е. измерения TEER, иммунофлуоресцентное окрашивание и т.д.; Тем не менее, это не рекомендуется, так как остаточный флуоресцентный индикатор вероятен и может повлиять на анализ. Определите коэффициент кажущейся проницаемости (Papp) по следующей формуле:ΔQ / Δt = концентрация флуоресцентного индикатора, прошедшего через монослой в базолатеральную камеру вставки для клеточной культуры в течение определенного периода времени, измеренная по интенсивности флуоресценции и экстраполированная на μг/мл с помощью стандартной кривойA = площадь поверхности вставок для клеточной культурыCo = концентрация флуоресцентного индикатора, добавляемого в апикальную камеру вставки для клеточной культуры, в мкг/мл 5. Иммунофлуоресцентное окрашивание 2D-монослоя органоидного происхождения Удалите однослойные питательные среды из вкладыша для клеточных культур с помощью вакуумной всасывания и добавьте 200 мкл 4% параформальдегида (PFA). Инкубировать при комнатной температуре в течение 15-30 мин для фиксации клеток. Удалите PFA с помощью вакуумного отсоса и промойте 100 μL PBS 2x. Пермеабилизируйте клетки 100 мкл 0,3% Triton X-100 в 2% бычьем сывороточном альбумине (BSA) в PBS путем инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут. Удалите надосадочную жидкость с помощью вакуумного отсоса и промойте 100 μл PBS 2x. Удалите надосадочную жидкость и замените ее 2% BSA в PBS и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа для блокировки. Удалите надосадочную жидкость, внесите 100 мкл первичного антитела, разведенного в 2% BSA в PBS и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч, или в течение ночи при 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации используемых первичных антител приведены в Таблице материалов. Если не указано иное, соблюдаются рекомендации производителя. Удалите надосадочную жидкость и промойте 100 мкл PBS 3x. Внесите 100 мкл вторичного антитела, разведенного в 2% BSA в PBS, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч или в течение ночи при 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно пропустить, если используемое первичное антитело конъюгировано с флуоресцентным зондом. Концентрации используемых вторичных антител приведены в Таблице материалов. Если не указано иное, соблюдаются рекомендации производителя. Удалите надосадочную жидкость и промойте 100 мкл PBS 3x. Необязательно: Для встречного окрашивания F-актина и ядер (DAPI) приготовьте, смешав оба зонда в соответствующем разведении (в соответствии с рекомендацией производителя) в PBS, нанесите 100 мкл и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Удалите надосадочную жидкость и промойте 100 мкл PBS 3x. Аккуратно вырезаем клеточную культуру, вставляем мембрану лезвием скальпеля и устанавливаем на предметное стекло с монтажным раствором. Положите крышку и наблюдайте.

Representative Results

Этот протокол надежно генерирует надежные 2D-монослои, полученные из органоидов кишечника крупного рогатого скота, из тонкого и толстого кишечного тракта, имитируя сложность кишечного эпителия in vivo . В этом методе используются зрелые органоиды, полученные из образцов кишечного крипты здорового крупного рогатого скота, выращенного в оптимизированных условиях. Интересно, что успешные и воспроизводимые условия для двухмерных монослоев, полученных из органоидов, уникальны для сегмента кишечника (Таблица 1). Это подчеркивает важность наличия оптимизированных методов культивирования для интересующего сегмента кишечника. Через 1 день после посева диссоциированных зрелых органоидов на вставку-культуру клеточной культуры образовался двумерный монослой (рис. 2А). Однако, несмотря на этот первоначальный вид, измерения TEER как для подвздошных, так и для ректальных монослоев оставались низкими на этой стадии (рис. 1C). Более того, анализ парацеллюлярной проницаемости показал, что монослой, уже через 1 день культивирования, позволяет трассеру FITC-декстрана с массой 4 кДа проходить через клеточный слой (рис. 1C). К3-му дню культивирования оба типа 2D-монослоев, полученных из органоидов, показали значительное созревание, о чем свидетельствуют повышенные значения TEER и устойчивость к индикатору FITC-декстрана 4 кДа, тенденция, которая продолжалась до 5-го дня культивирования. Особенно заметной является межвидовая изменчивость, когда, несмотря на более низкие значения TEER двумерных монослойных культур крупного рогатого скота, полученных из органоидов, по сравнению с аналогами человека и собаки в аналогичных условиях 12,13,14,15, целостность мембраны остается нетронутой. Этот вывод сделан на основании соответствующей реакции монослоев в анализах проницаемости, что позволяет предположить, что низкие значения TEER в образцах крупного рогатого скота не обязательно отражают отсутствие барьерной функции. Эта целостность имеет решающее значение для функционального эпителиального барьера и эффективно демонстрируется благодаря тщательной интерпретации результатов анализа проницаемости наряду с измерениями TEER. Визуализация клеточной демаркации и хорошо развитых микроворсинок на апикальной поверхности 2D-монослоев с помощью сканирующей электронной микроскопии, отображающей специализированные микроанатомические структуры, дальнейшее усиленное созревание как подвздошных, так и ректальных 2D-монослоев, полученных из органоидов подвздошной кишки (рис. 2B). Кроме того, иммунофлуоресцентное окрашивание 2D-монослоев подтвердило наличие апикальной щеточной границы, базолатеральных адгезивных соединений и слизеобразующих бокаловидных клеток как в подвздошной кишке (рис. 3A), так и в ректальном (рис. 3B) двухмерных монослоях, полученных из органоидов. Эти результаты подтверждают, что разработанный 2D-монослой является сложным по составу и формированию, не только выражая ключевые особенности интактного кишечного эпителия, но и состоя из многолинейной клеточной популяции. Успешная разработка 2D-монослоя зависит от прилегания клеток к ECM и роста к слиянию для создания неповрежденного эпителиального слоя. В частности, неравномерное распределение ВКМ или неоптимальные условия во время инкубации на вставке для клеточной культуры могут привести к частичному отслоению клеточного слоя, особенно заметному по его краям (рис. 4Ai). Эта проблема еще больше усугубляется, если клетки засеяны с более высокой, чем оптимальная, плотностью или если посевные клетки неравномерно распределены по поверхности культивирования, что часто происходит из-за неполной диссоциации органоидов в одноклеточную суспензию. Такое неравномерное распределение может привести к образованию разрывов внутри монослоя и/или 3D-морфогенезу на вставке клеточной культуры (рисунок 4Aii). Напротив, подсев клеток также может привести к неудачному или замедленному развитию монослоя в течение ожидаемого периода культивирования, что непреднамеренно влияет на эффективность последующих исследований с использованием 2D-монослойной системы (рис. 4Aiii). Кроме того, загрязнение системы культивирования может также привести к образованию пробелов внутри монослоя, разрушая однажды сформированный сливающийся монослой на более поздней стадии культивирования (рисунок 4Aiv). На устойчивые значения TEER и реакцию парацеллюлярной проницаемости могут влиять нарушения в клеточном слое из-за агрессивных методов промывки или обработки, даже если вышеупомянутые потенциальные причины неудачи не были обнаружены до этих анализов (рис. 4B). Таким образом, тщательное обращение с клетками и оценка образования или разрушения монослоев имеют первостепенное значение для успешной разработки 2D-монослоев, полученных из органоидов, за счет эффективного применения стратегий устранения неполадок. Рисунок 2: Микроскопическая характеристика двумерных монослоев, полученных из бычьих подвздошных и ректальных органоидов. (A) Репрезентативные фазово-контрастные микроскопические изображения 2D-монослоев в 1-й и 3-й день (D1 и D3) культивирования на вставке для клеточной культуры. Масштабная линейка = 100 мкм. (B) Репрезентативные изображения сканирующей электронной микроскопии двухмерных монослоев с меньшим (слева) и большим (вправо) увеличениями. Детальная структура клеточной поверхности, включая микроворсинки, может быть оценена как в подвздошной (верхней), так и в ректальной (нижней) монослоях. Левая масштабная линейка = 10 μм, правая масштабная линейка = 2 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Иммунофлуоресцентная характеристика двумерных монослоев, полученных из подвздошных и ректальных органоидов. (А, Б) На панели (А) показана подвздошная кишка, а на панели (В) — ректальные органоиды. Слева волокна F-актина выделены фаллоидином (красным), иллюстрирующим архитектуру цитоскелета и формирование апикальной границы кисти. На среднем изображении запечатлена базолатеральная локализация адгезивных соединений, отмеченных Е-кадгерином (зеленым цветом), что указывает на межклеточную адгезию и целостность монослоя. Справа присутствие бокаловидных клеток, продуцирующих муцин, идентифицируется с помощью SNA (зеленого цвета), с изображением z-стека, изображающим апикальную секрецию муцина в монослое подвздошной кишки. Ядра на всех изображениях были покрыты DAPI (синим цветом). Кроме того, визуализация z-стека на всех изображениях дополнительно демонстрирует формирование одного клеточного слоя внутри культивальной вставки. Масштабная линейка = 25 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Характеристика субоптимального формирования 2D монослоя. (A) Репрезентативные фазово-контрастные изображения, демонстрирующие (i) частичное отслоение монослоя по краю вставки клеточной культуры; (ii) развитие 3D-наростов и образование щелей внутри монослоя; (iii) неполное или замедленное формирование монослоя из-за более низкой, чем оптимальная, плотности посева, что проявляется в виде неравномерного прилегания клеток; и (iv) образование разрывов в однажды сформированном 2D-монослое на более поздней стадии, вероятно, в результате предполагаемого загрязнения. Масштабные линейки = 100 мкм. (B) Снижение измерений TEER в сочетании с повышением профилей проницаемости после 3-го дня указывает на неспособность установить стабильные и функциональные эпителиальные барьеры. Результаты представлены в виде среднего ± стандартной погрешности среднего (SEM) из одного эксперимента с двумя техническими репликами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Дополнительный рисунок 1: Изменения плотности в культурах кишечных органоидов крупного рогатого скота в гидрогеле на основе ECM. Кишечные органоиды крупного рогатого скота, культивируемые в гидрогеле на основе ECM; (А) высокая плотность и (Б) низкая плотность. Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл. Дополнительная таблица 1: Обобщенные сигналы донора тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Здоровье кишечного тракта имеет первостепенное значение как для продуктивности, так и для общего благополучия крупного рогатого скота16. Используя технологию 2D-монослоя, полученную из органоидов, ученые теперь могут более точно имитировать сложную структуру эпителия кишечника крупного рогатого скотав условиях in vitro. Этот инновационный подход не только воспроизводит разнообразный клеточный состав слизистой оболочки кишечника, включая ее многоклеточные линии, но и фиксирует ключевые функциональные характеристики, такие как секреция слизи и наличие микроворсинок, необходимых для понимания физиологии и патологии кишечника. Разработка специализированных протоколов культивирования для сегментов подвздошной и прямой кишки привела к появлению передовой платформы, которая значительно расширяет возможности изучения здоровья кишечника крупного рогатого скота. Этот сложный подход позволяет проводить детальные исследования взаимодействия между зоонозными патогенами и кишечной средой крупного рогатого скота. Возможность точного воспроизведения и изучения уникальных аспектов экосистемы кишечника крупного рогатого скота in vitro является значительным шагом на пути к разработке целенаправленных стратегий по улучшению здоровья скота и смягчению последствий распространения зоонозных заболеваний.

Тем не менее, для обеспечения успешной разработки 2D-монослоя с использованием органоидов бычьего кишечника крайне важно поддерживать здоровье и жизнеспособность как органоидов, так и их диссоциированных отдельных клеток. Бережное обращение и минимизация стресса имеют первостепенное значение для сохранения целостности и функциональности клеток, которые необходимы для эффективного роста органоидов и последующего создания функционирующего монослоя. Кроме того, достижение однородного монослоя зависит от успешной диссоциации органоидов до отдельных клеток без образования больших скоплений. Такие скопления могут нарушить распределение клеток и нарушить структуру монослоя. Таким образом, использование точных методов для плавной диссоциации имеет решающее значение, что приводит к стабильной суспензии одиночных клеток. Кроме того, становится полезным сведение к минимуму нарушений во время клеточной адгезии и при вымывании избытка неадгезивных клеток. Этот подход особенно важен для решения потенциальных проблем с 3D-морфогенезом, тем самым повышая общее качество монослоя.

Заметной проблемой с гидрогелями биологического происхождения на основе ECM является изменение состава от партии кпартии17. Хотя это не наблюдалось при использовании описанных протоколов и материалов, вариации состава ECM от партии к партии могут создать проблемы для успешной разработки монослоев. Если при изменении продуктов, брендов или номеров партий ECM, формирование монослоя нарушается, могут потребоваться шаги по оптимизации для определения подходящей концентрации ECM, необходимой для нанесения покрытия на вставки клеточных культур.

Кроме того, корректировка питательной среды до комнатной температуры перед внесением каких-либо изменений является критически важным шагом, который помогает смягчить тепловой шок, защитить здоровье клеток и сохранить качество как органоидных, так и монослойных культур. Щадящая промывка также имеет первостепенное значение для поддержания целостности монослоя во время его формирования и последующих анализов, а избегание сбоев может предотвратить неточности в результатах. Замена PBS на сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS) оказалась полезной для минимизации отслойки монослоя, когда она становилась проблемой во время повторного промывания или длительного воздействия PBS, например, при анализе парацеллюлярной проницаемости. Наконец, адаптация питательной среды к конкретным потребностям клеток из различных сегментов кишечного тракта, таких как подвздошная кишка и прямая кишка, имеет важное значение для точной репликации in vivo . Эта специфичность обеспечивает оптимальное здоровье и функциональность клеток, способствуя точному моделированию физиологии кишечника крупного рогатого скота и взаимодействия с патогенами, тем самым подчеркивая эти важнейшие этапы исследований органоидов.

Помимо использования щадящей практики обращения с клетками, формирование хорошей технической компетентности, связанной с подсчетом клеток и измерениями TEER, имеет решающее значение для успешной разработки функционирующего 2D-монослоя. Поскольку как слишком низкая, так и слишком высокая плотность затравки, возникающая в результате чрезмерного или недостаточного подсчета клеток, соответственно, может привести к нарушению роста монослоя. Рекомендуется тщательно проверять количество клеток и обеспечивать надлежащую плотность посева в тех случаях, когда есть подозрение на неточную плотность посева. Кроме того, неадекватные методы измерения TEER могут привести к разрушению монослоя из-за случайных царапин на электродах. Осторожное введение электродов в апикальную камеру и уделение особого внимания сохранению их вертикальной ориентации относительно поверхности мембраны может помочь снизить риск случайного повреждения монослоев.

Описанные здесь методы анализа парацеллюлярной проницаемости были адаптированы из предыдущего протокола18. Для повышения точности и надежности результатов вносятся изменения в представленный протокол, которые включают в себя многократные отборы проб в течение 120 минут и замену отобранной аликвоты равными количествами PBS. Поддержание общего объема в камере имеет решающее значение по нескольким причинам: это сохраняет осмотический баланс, обеспечивает целостность ячейки, поддерживает градиент концентрации, необходимый для точной оценки проницаемости, и предотвращает изменения гидростатического давления, которые могут повлиять на скорость транспортировки. Эта практика пополнения базолатеральной камеры свежим PBS, эквивалентным объему отобранного PBS, содержащего флуоресцентный индикатор, имеет решающее значение для сохранения этих условий, позволяя точно и значимо оценивать проницаемость монослоя. Анализ парацеллюлярной проницаемости служит дополнением к измерению TEER, оценивая движение молекул-индикаторов через монослой напрямую. Кроме того, сравнение значений TEER в различных лабораториях может не дать соответствующего понимания, поскольку на эти значения могут влиять многочисленные переменные, такие как температура и конкретные условия, в которых культивируются клетки, включая типы клеток, количество пассажей и состав питательной среды19. Анализ парацеллюлярной проницаемости обеспечивает функциональную оценку in vitro эффективной экспрессии адгезенов и плотных соединений в эпителиальном барьере20.

В то время как разработка 2D-монослоев из 3D-органоидов представляет собой значительный прогресс в технологии культивирования, важно признать ограничения, связанные с 2D-монослоями. Одним из основных недостатков является то, что эта система остается статичной, лишенной динамической стимуляции, обнаруженной в среде in vivo . Кроме того, изменение содержания кислорода в культуральной системе сопряжено с трудностями из-за ее открытой конфигурации с использованием культуральных планшетов с крышками, что делает ее менее пригодной для долгосрочного совместного культивирования с анаэробными бактериями. Эти ограничения потенциально могут быть устранены путем внедрения более динамичных культуральных платформ, таких как микрофлюидные системы21, которые обеспечивают более контролируемую и физиологически значимую среду. Кроме того, крайне важно признать, что, хотя современные условия культивирования богаты питательными веществами, полезными для поддержания роста стволовых клеток, они не могут быть оптимальными для индуцирования физиологической дифференцировки эпителиальных клеток. Это несоответствие подчеркивает необходимость оптимизации в будущих исследованиях, чтобы точно имитировать условия in vivo и поддерживать процесс дифференцировки. Устраняя эти ограничения и совершенствуя эти подходы, полезность и применимость технологий органоидных культур повышаются, приближаясь к воспроизведению сложной динамики и взаимодействий желудочно-кишечного тракта in vitro.

Протокол создания 2D-монослоев из тканей подвздошной кишки и прямой кишки крупного рогатого скота предлагает исследователям ценную in vitro модель люминального интерфейса эпителия тонкой и толстой кишки. Эта модель открывает широкие возможности для применения в фундаментальных исследованиях питания животных, в частности, при изучении того, как питательные вещества усваиваются в различных условиях. Заметной областью интереса является исследование синдрома дырявого кишечника, характеризующегося аномальным повышением проницаемости желудочно-кишечного тракта, часто вызванным изменениями в рационе питания и экстремальнымитемпературами окружающей среды. Более того, эта модель служит важным инструментом для изучения сложных взаимодействий между микробиомом кишечника и его хозяином. Это позволяет изучать, как комменсальные микроорганизмы могут влиять на здоровье организма хозяина, обращаясь к важнейшему аспекту ветеринарии и медицинской науки 1,24. Кроме того, пищевые патогены человека часто обнаруживаются в виде комменсалов в различных сегментах кишечника крупного рогатого скота 8,9,25, этот протокол позволяет детально изучить конкретные условия, которые позволяют этим зоонозным агентам процветать в соответствующих нишах.

В ходе этого исследования было замечено, что монослои, полученные из ректальных и подвздошных органоидов, требуют различных условий для успешного развития. В частности, при первоначальном посеве монослоев, полученных из ректальных органоидов, на вкладыши клеточных культур, приготовленные с использованием 2% гидрогеля на основе ECM в базальных средах в течение 1 ч, отмечались большие отверстия и отслаивание клеток. Эта проблема была решена путем перехода на специализированную ректальную монослойную питательную среду и продления инкубационного периода до ночи перед посевом, в то время как монослои, полученные из подвздошных органоидов, были успешно разработаны с использованием более короткого протокола подготовки. Кроме того, добавление CHIR99021 в питательную среду последовательно улучшало образование ректальных монослоев26 , но не было необходимым для подвздошных монослоев27. Кроме того, монослои подвздошной кишки требовали более высокой плотности клеток для успешного развития по сравнению с ректальными органоидами27. Эти оптимизированные условия (Таблица 1) неоднократно разрабатывали монослои, которые поддерживают устойчивую барьерную целостность, что подчеркивает важность адаптации условий культивирования к конкретному сегменту кишечника.

Доступ к модели, которая точно отражает сложность многоклеточной линии кишечника in vivo , имеет решающее значение для этих исследований. Это позволяет исследователям точно имитировать естественные условия кишечной среды, обеспечивая более надежную основу для экспериментов. С помощью этого протокола исследователи получают в свое распоряжение надежную модель, которая расширяет их исследовательские возможности, что потенциально может привести к революционным открытиям в их областях исследований. Такой подход не только способствует пониманию здоровья кишечника и его заболеваний, но и помогает в разработке стратегий по улучшению управления животноводством и безопасности пищевых продуктов.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было частично поддержано Офисом директора Национальных институтов здравоохранения (K01OD030515 и R21OD031903 YMA) и исследовательским грантом WSU VCS для резидентов и аспирантов (GDD). Авторы хотели бы поблагодарить участвующую скотобойню за предоставление донорского скота.

Materials

Basal Medium
Advanced DMEM/F12 (1X) Gibco 12634-010 n/a
GlutaMAX-I (100X) Gibco 35050-061 2 mM
HEPES (1M) Gibco 15630-080 10 mM
Pen Strep Glutamine (100X) Gibco 10378-016 1X
Organoid Culture Medium (Supplements to Basal Medium)
A-83-01 Sigma-Aldrich SML0788-5MG 500 nM
B27 Supplement (50X) Gibco 17504-001 1X
[Leu15]-Gastrin I human Sigma-Aldrich G9145-.5MG 10 nM
Murine EGF PeproTech 315-09-500UG 50 ng/mL
Murine Wnt-3a PeproTech 315-20-10UG 100 ng/mL
N-Acetyl-L-cysteine MP Biomedicals 194603 1 mM
N-2 MAX Media Supplement (100X) R&D Systems AR009 1X
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636-100G 10 mM
Noggin Conditioned Medium n/a n/a 10 vol/vol %
Primocin InvivoGen ant-pm-2 100 µg/mL
R-Spondin-1 Conditioned Medium n/a n/a 20 vol/vol %
SB202190 Sigma-Aldrich S7067-25MG 10 µM
Monolayer Culture Medium (Supplements to Organoid Culture Medium)
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046-5MG 2.5 µM
HI FBS Gibco 10438-034 20 vol/vol %
LY2157299 Sigma-Aldrich SML2851-5MG 500 nM
Y-27632 StemCellTechnologies 72308 10 µM
Reagents
Alexa Fluor 488 Mouse anti-E-cadherin BD Biosciences 560061 1:200 dilution
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287 1:400 dilution
BSA Cytiva SH30574.02 2 w/vol %
Cell Recovery Solution Corning 354253 n/a
DAPI Solution (1 mg/mL) Thermo Scientific 62248 1:1000 dilution
DPBS (1X) Gibco 14190-144 n/a
Fluorescein Isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich FD4-100MG 0.5 mg/mL
Matrigel Matrix Corning 354234 n/a
Paraformaldehyde Solution (4%) Thermo Scientific J19943K2 n/a
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36930 n/a
SNA, EBL, Fluorescein Vector Laboratories FL-1301 1:100 dilution
Triton X-100 Thermo Scientific A16046.AE 0.3 vol/vol %
TrypLE Express Gibco 12605-028 n/a
Trypan Blue Solution, 0.4% VWR Life Science K940-100ML n/a
Materials and Equipment
0.4 µm Cell Culture Insert Falcon 353095
24-well Cell Culture Plate Corning 3524
48-well Cell Culture Plate Thermo Scientific 150687
70 µm Sterile Cell Strainer Fisher Scientific 22-363-548
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-One 655086
Centrifuge Eppendorf 5910Ri
CO2 Incubator Thermo Scientific 370
Epithelial Volt-Ohm Meter Millipore Millicell ERS-2
Hemocytometer LW Scientific CTL-HEMM-GLDR
Inverted Confocal Microscope Leica Microsystems SP8-X
Inverted Phase-Contrast Microscope Leica Microsystems DMi1
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-540-B
Microplate Reader Molecular Devices SpecrtraMax i3x
Microscope Slides Fisher Scientific 22-034-486
Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20C
Scalpel Blade iMed Scientific – #11 carbon steel
Vortex Mixer Scientific Industries SI-0236
Software
LAS X imaging software Leica Microsystems LAS X 3.7.6.25997
Microplate Reader software Molecular Devces SoftMax Pro 7.1.2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Min, S., Kim, S., Cho, S. W. Gastrointestinal tract modeling using organoids engineered with cellular and microbiota niches. Exp Mol Med. 52 (2), 227-237 (2020).
  2. Fitzgerald, S. F., et al. Shiga toxin sub-type 2a increases the efficiency of Escherichia coli O157 transmission between animals and restricts epithelial regeneration in bovine enteroids. PLoS Pathogens. 15 (10), e1008003 (2019).
  3. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trend Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).
  4. Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Vet Res. 52 (1), 33 (2021).
  5. Kawasaki, M., Dykstra, G. D., McConnel, C. S., Burbick, C. R., Ambrosini, Y. M. Adult bovine-derived small and large intestinal organoids: In vitro development and maintenance. J Tissue Eng Regene Med. 2023, e3095002 (2023).
  6. Kvidera, S. K., et al. Intentionally induced intestinal barrier dysfunction causes inflammation, affects metabolism, and reduces productivity in lactating Holstein cows. J Dairy Sci. 100 (5), 4113-4127 (2017).
  7. Crawford, C. K., et al. Inflammatory cytokines directly disrupt the bovine intestinal epithelial barrier. Sci Rep. 12 (1), 14578 (2022).
  8. Heredia, N., García, S. Animals as sources of food-borne pathogens: A review. Animal Nutri. 4 (3), 250-255 (2018).
  9. Naylor, S. W., et al. Lymphoid follicle-dense mucosa at the terminal rectum is the principal site of colonization of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in the bovine host. Infect Immun. 71 (3), 1505-1512 (2003).
  10. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Rep. 26 (9), 2509-2520.e4 (2019).
  11. Pullinger, G. D., et al. Systemic translocation of Salmonella enterica Serovar Dublin in cattle occurs predominantly via efferent lymphatics in a cell-free niche and requires type III secretion system 1 (T3SS-1) but not T3SS-2. Infect Immun. 75 (11), 5191-5199 (2007).
  12. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiol Spectr. 9 (1), e0000321 (2021).
  13. Varani, J., McClintock, S. D., Aslam, M. N. Cell-matrix interactions contribute to barrier function in human colon organoids. Front Med. 9, 838975 (2022).
  14. Freire, R., et al. Human gut derived-organoids provide model to study gluten response and effects of microbiota-derived molecules in celiac disease. Sci Rep. 9, 7029 (2019).
  15. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), e0231423 (2020).
  16. Kogut, M. H., Arsenault, R. J. Editorial: Gut health: The new paradigm in food animal production. Front Vet Sci. 3, 71 (2016).
  17. Lingard, E., et al. Optimising a self-assembling peptide hydrogel as a Matrigel alternative for 3-dimensional mammary epithelial cell culture. Biomater Adv. 160, 213847 (2024).
  18. Turksen, K. . Permeability Barrier: Methods and Protocols. , (2011).
  19. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  20. Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in Transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
  21. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659 (2018).
  22. Sanz-Fernandez, M. V., et al. Targeting the hindgut to improve health and performance in cattle. Animals. 10 (10), 1817 (2020).
  23. Gressley, T. F., Hall, M. B., Armentano, L. E. Ruminant nutrition symposium: Productivity, digestion, and health responses to hindgut acidosis in ruminants. J Anim Sci. 89 (4), 1120-1130 (2011).
  24. O’Hara, E., Neves, A. L. A., Song, Y., Guan, L. L. The role of the gut microbiome in cattle production and health: Driver or passenger. Ann Rev Animal Biosci. 8 (2020), 199-220 (2020).
  25. Beach, J. C., Murano, E. A., Acuff, G. R. Prevalence of Salmonella and Campylobacter in beef cattle from transport to slaughter. J Food Protect. 65 (11), 1687-1693 (2002).
  26. Kawasaki, M., Ambrosini, Y. M. Accessible luminal interface of bovine rectal organoids generated from cryopreserved biopsy tissues. PLoS One. 19 (3), e0301079 (2024).
  27. Kawasaki, M., McConnel, C. S., Burbick, C. R., Ambrosini, Y. M. Pathogen-epithelium interactions and inflammatory responses in Salmonella Dublin infections using ileal monolayer models derived from adult bovine organoids. Scientific Reports. 14 (1), 11479 (2024).

Tags

BovineOrganoidIntestinalMonolayerGastrointestinalIn Vitro ModelEpitheliumTransepithelialPermeabilityImmunocytochemistryPhysiologyPublic HealthBiomedicalTranslational ResearchAgricultureAnimal WelfareFood Safety

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Dykstra, G. D., Kawasaki, M., Ambrosini, Y. M. Advancements in Bovine Organoid Technology Using Small and Large Intestinal Monolayer Interfaces. J. Vis. Exp. (208), e67010, doi:10.3791/67010 (2024).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image