Questo studio presenta un protocollo per la generazione di monostrati 2D intestinali bovini da organoidi, offrendo un migliore accesso per lo studio delle interazioni ospite-patogeno. Include metodi per valutare l’integrità e la funzionalità della membrana, avanzando modelli in vitro che imitano la fisiologia gastrointestinale del bestiame. Questo approccio promette significativi benefici biomedici e agricoli, tra cui strategie di trattamento avanzate.
L’avanzamento delle conoscenze sulla fisiologia gastrointestinale e sulle sue malattie dipende in modo critico dallo sviluppo di modelli in vitro precisi e specie-specifici che imitino fedelmente i tessuti intestinali in vivo . Ciò è particolarmente importante per lo studio delle interazioni ospite-patogeno nei bovini, che sono serbatoi significativi di agenti patogeni che comportano gravi rischi per la salute pubblica. Gli organoidi 3D tradizionali offrono un accesso limitato alla superficie apicale dell’epitelio intestinale, un ostacolo superato dall’avvento delle colture monostrato 2D. Queste colture, derivate da cellule organoidi, forniscono una superficie luminale esposta per uno studio più accessibile. In questa ricerca, viene introdotto un protocollo dettagliato per la creazione e il mantenimento di colture monostrato 2D da cellule di organoidi bovini dell’intestino tenue e crasso. Questo metodo include protocolli per valutare l’integrità della membrana attraverso la resistenza elettrica transepiteliale e la permeabilità paracellulare insieme a tecniche di colorazione immunocitochimica. Questi protocolli gettano le basi per la creazione e la caratterizzazione di un sistema di coltura monostrato bovina 2D, spingendo i confini di queste applicazioni metodologiche nella ricerca biomedica e traslazionale di importanza per la salute pubblica. L’impiego di questo approccio innovativo consente lo sviluppo di modelli in vitro fisiologicamente pertinenti per esplorare sia gli stati normali che quelli malati della fisiologia intestinale dei bovini. Le implicazioni per i progressi biomedici e agricoli sono profonde e aprono la strada a trattamenti più efficaci per i disturbi intestinali dei bovini, migliorando così sia il benessere degli animali che la sicurezza alimentare.
La coltura di cellule staminali epiteliali intestinali in colture tridimensionali (3D), note come organoidi intestinali, segna un progresso significativo nella tecnologia in vitro per lo studio delle funzioni intestinali, della nutrizione e delle interazioni con i patogeni 1,2. Questi organoidi imitano la complessa struttura dell’epitelio intestinale in vivo autoreplicandosi e organizzandosi in formazioni 3D che comprendono varie linee cellulari intestinali3. Questa caratteristica evidenzia il loro notevole potenziale per far progredire la comprensione della biologia intestinale.
Il crescente interesse per l’applicazione della tecnologia degli organoidi intestinali agli animali da allevamento richiede il perfezionamento delle tecniche di coltura e mantenimento 4,5. L’importanza di questa tecnologia è sottolineata dal suo potenziale impatto sullo studio della salute intestinale degli animali da allevamento, che svolge un ruolo critico nella loro produttività e, di conseguenza, nell’economia dell’industria alimentare-animale, influenzando il benessere degli animali e i costi operativi 6,7. In particolare, l’impiego di colture di organoidi intestinali per esplorare la funzione intestinale dei bovini è di fondamentale importanza, dato il loro ruolo come serbatoi per patogeni enterici zoonotici, come Salmonella spp. ed Escherichia coli (E. coli) O157:H78. Questi patogeni sono localizzati in particolari segmenti dell’intestino, il che rende essenziale differenziare i metodi di coltura degli organoidi intestinali per segmento intestinale per migliorare la precisione negli studi9.
Un ostacolo significativo nello studio degli organoidi intestinali è l’accesso limitato alla superficie apicale della cellula epiteliale10. Quando vengono coltivate all’interno di una matrice extracellulare (ECM), le cellule si orientano naturalmente in modo che la superficie basale sia rivolta verso l’esterno e la superficie apicale sia diretta verso l’interno10. Per affrontare questa sfida, vengono presentati metodi che prevedono la dissociazione di organoidi 3D in singole cellule e la loro semina in inserti di coltura cellulare semipermeabili. Questa configurazione stabilisce un’interfaccia tra la superficie apicale e un compartimento basolaterale. Questo protocollo dimostra che le cellule derivate da organoidi intestinali bovini possono formare un monostrato 2D coerente, come evidenziato dalle misurazioni della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e dai saggi di permeabilità paracellulare. Inoltre, lo sviluppo della polarità cellulare con bordi a spazzola e giunzioni strette nelle cellule monostrato 2D derivate da organoidi è confermato attraverso l’immunofluorescenza e la microscopia elettronica, riflettendo le proprietà dell’epitelio intestinale in vivo .
In questo studio, l’ileo rappresenta il tratto intestinale tenue e il retto indica il tratto intestinale crasso. Queste selezioni si basano su patogeni enterici rilevanti come Salmonella spp., che può traslocare l’ileo11, ed E. coli O157:H7 noto per colonizzare principalmente il retto9 nei bovini. La selezione di questi specifici segmenti intestinali evidenzia la necessità di adattare i metodi di coltura degli organoidi intestinali alla regione intestinale per garantire la precisione nella ricerca. Questi metodi descrivono in dettaglio la procedura per coltivare efficacemente un’interfaccia monostrato 2D derivata da organoidi da questi segmenti intestinali, fornendo un modello robusto per esplorare la salute dell’intestino del bestiame, le infezioni da agenti patogeni e le interazioni tra il microbioma intestinale e l’ospite.
La salute del tratto intestinale è fondamentale sia per la produttività che per il benessere generale dei bovini16. Sfruttando la tecnologia 2D monostrato derivata da organoidi, gli scienziati possono ora imitare in modo più accurato la complessa struttura dell’epitelio intestinale bovino in un contesto in vitro 5. Questo approccio innovativo non solo riproduce la diversa composizione cellulare del rivestimento intestinale, comprese le sue linee multicellulari, ma cattura anche caratteristiche funzionali chiave, come la secrezione di muco e la presenza di microvilli, essenziali per comprendere la fisiologia e la patologia intestinale3. Lo sviluppo di protocolli di coltura su misura per segmenti dell’ileo e del retto ha dato origine a una piattaforma avanzata che migliora significativamente la capacità di studiare la salute dell’intestino bovino. Questo approccio sofisticato consente di studiare in dettaglio le interazioni tra i patogeni zoonotici e l’ambiente intestinale bovino. La capacità di replicare e studiare da vicino gli aspetti unici dell’ecosistema intestinale bovino in vitro è un passo significativo verso lo sviluppo di strategie mirate per migliorare la salute del bestiame e mitigare la diffusione delle malattie zoonotiche.
Tuttavia, per garantire il successo dello sviluppo di monostrati 2D utilizzando organoidi intestinali bovini, è fondamentale mantenere la salute e la vitalità sia degli organoidi che delle loro singole cellule dissociate. Un’attenta manipolazione e la riduzione al minimo dello stress sono fondamentali per preservare l’integrità e la funzionalità delle cellule, essenziali per l’efficace crescita degli organoidi e la successiva creazione di un monostrato funzionante. Inoltre, il raggiungimento di un monostrato uniforme si basa sulla dissociazione riuscita degli organoidi in singole cellule senza formare grandi grumi. Tali grumi possono interrompere la distribuzione cellulare e compromettere la struttura del monostrato. Pertanto, l’impiego di tecniche precise per una dissociazione regolare è fondamentale, in quanto si ottiene una sospensione uniforme di una singola cellula. Inoltre, diventa utile ridurre al minimo i disturbi durante l’adesione cellulare e quando si lavano via le cellule non aderenti in eccesso. Questo approccio è particolarmente importante per affrontare potenziali problemi con la morfogenesi 3D, migliorando così la qualità complessiva del monostrato.
Una sfida nota con gli idrogel a base di ECM di origine biologica è la variazione da lotto a lotto nella composizione17. Sebbene ciò non sia stato osservato utilizzando i protocolli e i materiali descritti, le variazioni da lotto a lotto nella composizione dell’ECM potrebbero rappresentare una sfida per il successo dello sviluppo del monostrato. Se la formazione del monostrato è compromessa quando i prodotti, le marche o i numeri di lotto ECM cambiano, potrebbero essere necessarie fasi di ottimizzazione per determinare la concentrazione ECM appropriata richiesta per il rivestimento degli inserti per colture cellulari.
Inoltre, regolare il terreno di coltura a temperatura ambiente prima di apportare qualsiasi modifica è un passaggio fondamentale che aiuta a mitigare lo shock termico, proteggere la salute delle cellule e mantenere la qualità sia delle colture di organoidi che di monostrato. Anche le pratiche di lavaggio delicate sono fondamentali per mantenere l’integrità del monostrato durante la sua formazione e i successivi saggi, ed evitare interruzioni può prevenire imprecisioni nei risultati. La sostituzione del PBS con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) è sembrata utile per ridurre al minimo il distacco del monostrato quando diventava un problema durante il lavaggio ripetuto o l’esposizione prolungata al PBS, come nei saggi di permeabilità paracellulare. Infine, adattare il terreno di coltura per soddisfare le esigenze specifiche delle cellule provenienti da diversi segmenti del tratto intestinale, come l’ileo e il retto, è essenziale per replicare accuratamente le condizioni in vivo . Questa specificità garantisce una salute e una funzionalità cellulari ottimali, facilitando la modellazione precisa della fisiologia intestinale del bestiame e delle interazioni con i patogeni, evidenziando così queste fasi critiche nella ricerca sugli organoidi.
Oltre a impiegare una pratica delicata di manipolazione delle celle, lo sviluppo di una buona competenza tecnica associata al conteggio delle cellule e alle misure TEER è fondamentale per il successo dello sviluppo di un monostrato 2D funzionante. Poiché sia le densità di semina troppo basse che quelle troppo alte, risultanti rispettivamente da un conteggio eccessivo o insufficiente delle cellule, possono portare a una crescita compromessa del monostrato. Si consiglia di esaminare attentamente la conta cellulare e di garantire un’adeguata densità di semina nelle occasioni in cui si sospetta una densità di semina imprecisa. Inoltre, tecniche di misurazione TEER inadeguate possono causare l’interruzione del monostrato a causa di graffi involontari con gli elettrodi. Introdurre con cura gli elettrodi nella camera apicale e prestare particolare attenzione a mantenere il loro orientamento verticale rispetto alla superficie della membrana potrebbe aiutare a mitigare il rischio di danni accidentali ai monostrati.
I metodi di saggio della permeabilità paracellulare qui descritti sono stati adattati da un precedente protocollo18. Le modifiche al protocollo riportato, che includono campionamenti multipli superiori a 120 minuti e la sostituzione dell’aliquota campionata con quantità uguali di PBS, vengono apportate per migliorare l’accuratezza e l’affidabilità dei risultati. Mantenere il volume totale all’interno della camera è fondamentale per diversi motivi: preserva l’equilibrio osmotico, garantisce l’integrità delle cellule, mantiene il gradiente di concentrazione essenziale per un’accurata valutazione della permeabilità e previene le alterazioni della pressione idrostatica che potrebbero influire sulle velocità di trasporto. Questa pratica di riempire la camera basolaterale con PBS fresco equivalente al volume del PBS contenente tracciante fluorescente campionato è fondamentale per preservare queste condizioni, consentendo valutazioni accurate e significative della permeabilità del monostrato. Il test di permeabilità paracellulare funge da complemento alla misurazione TEER, valutando direttamente il movimento delle molecole traccianti attraverso il monostrato. Inoltre, il confronto dei valori TEER tra vari laboratori potrebbe non fornire informazioni rilevanti, poiché questi valori possono essere influenzati da numerose variabili, come la temperatura e le condizioni specifiche in cui le cellule vengono coltivate, inclusi i tipi di cellule, il numero di passaggi e la composizione del terreno di coltura19. Il test di permeabilità paracellulare fornisce una valutazione funzionale in vitro dell’efficace espressione di aderenze e giunzioni strette all’interno di una barriera epiteliale20.
Sebbene lo sviluppo di monostrati 2D da organoidi 3D rappresenti un progresso significativo nella tecnologia delle colture, è importante riconoscere i limiti associati ai monostrati 2D. Uno dei principali svantaggi è che questo rimane un sistema di coltura statico, privo della stimolazione dinamica che si trova nell’ambiente in vivo . Inoltre, la modifica del contenuto di ossigeno all’interno del sistema di coltura presenta sfide a causa della sua configurazione aperta che prevede piastre di coltura con coperchi, rendendolo meno adatto per la co-coltura a lungo termine con batteri anaerobici. Queste limitazioni potrebbero potenzialmente essere affrontate adottando piattaforme di coltura più dinamiche, come i sistemi microfluidici21, che offrono un ambiente più controllato e fisiologicamente rilevante. Inoltre, è fondamentale riconoscere che, sebbene le attuali condizioni di coltura siano ricche di nutrienti benefici per il mantenimento della crescita delle cellule staminali, potrebbero non essere ottimali per indurre la differenziazione fisiologica delle cellule epiteliali. Questa discrepanza evidenzia la necessità di un’ottimizzazione nella ricerca futura per imitare da vicino le condizioni in vivo e supportare il processo di differenziazione. Affrontando queste limitazioni e perfezionando questi approcci, l’utilità e l’applicabilità delle tecnologie di coltura degli organoidi vengono migliorate, avvicinandosi alla replica delle complesse dinamiche e interazioni del tratto gastrointestinale in vitro.
Il protocollo per la generazione di monostrati 2D da tessuti ileali e rettali bovini offre ai ricercatori un prezioso modello in vitro dell’interfaccia luminale dell’epitelio dell’intestino tenue e crasso. Questo modello apre vaste possibilità di applicazione negli studi fondamentali sulla nutrizione animale, in particolare nell’esame di come i nutrienti vengono assorbiti in varie condizioni. Un’area di notevole interesse è lo studio della sindrome dell’intestino permeabile, caratterizzata da un aumento anomalo della permeabilità gastrointestinale, spesso innescato da cambiamenti nella dieta e temperature ambientali estreme 22,23. Inoltre, questo modello funge da strumento essenziale per esplorare le complesse interazioni tra il microbioma intestinale e il suo ospite. Consente lo studio di come i microrganismi commensali possono influenzare la salute dell’organismo ospite, affrontando un aspetto cruciale della scienza veterinaria e medica 1,24. Inoltre, i patogeni di origine alimentare umana si trovano spesso come commensali in diversi segmenti dell’intestino del bestiame 8,9,25, questo protocollo consente studi dettagliati delle condizioni specifiche che consentono a questi agenti zoonotici di prosperare nelle rispettive nicchie.
Nel corso di questo studio, è stato osservato che i monostrati derivati da organoidi rettali e ileali richiedono condizioni diverse per uno sviluppo di successo. In particolare, quando i monostrati derivati da organoidi rettali sono stati inizialmente seminati su inserti di coltura cellulare preparati con idrogel a base di ECM al 2% in terreno basale per 1 ora, sono stati notati fori di grandi dimensioni e desquamazione cellulare. Questo problema è stato risolto passando a un terreno di coltura monostrato rettale specializzato ed estendendo il periodo di incubazione alla notte prima della semina, mentre i monostrati derivati da organoidi ileali sono stati sviluppati con successo utilizzando un protocollo di preparazione più breve. Inoltre, l’aggiunta di CHIR99021 al terreno di coltura ha costantemente migliorato la formazione di monostrati rettali26 , ma non è stata necessaria per i monostrati ileali27. Inoltre, i monostrati ileali richiedevano una densità cellulare più elevata per uno sviluppo di successo rispetto agli organoidi rettali27. Queste condizioni ottimizzate (Tabella 1) hanno ripetutamente sviluppato monostrati che mantengono l’integrità della barriera resistente, sottolineando l’importanza di adattare le condizioni di coltura allo specifico segmento intestinale.
L’accesso a un modello che rifletta accuratamente la complessità del lignaggio multicellulare dell’intestino in vivo è fondamentale per queste indagini. Consente ai ricercatori di imitare da vicino le condizioni naturali dell’ambiente intestinale, fornendo una base più affidabile per gli esperimenti. Con questo protocollo, i ricercatori sono dotati di un modello robusto che migliora le loro capacità di ricerca, portando potenzialmente a scoperte rivoluzionarie nei loro campi di studio. Questo approccio non solo contribuisce a comprendere la salute e le malattie intestinali, ma aiuta anche nello sviluppo di strategie per migliorare la gestione del bestiame e la sicurezza alimentare.
The authors have nothing to disclose.
Questo studio è stato supportato in parte dall’Ufficio del Direttore del National Institutes of Health (K01OD030515 e R21OD031903 a YMA) e dalla WSU VCS Resident and Graduate Student Research Grant (a GDD). Gli autori ringraziano il macello partecipante per aver fornito il bestiame donatore.
Basal Medium | |||
Advanced DMEM/F12 (1X) | Gibco | 12634-010 | n/a |
GlutaMAX-I (100X) | Gibco | 35050-061 | 2 mM |
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | 10 mM |
Pen Strep Glutamine (100X) | Gibco | 10378-016 | 1X |
Organoid Culture Medium (Supplements to Basal Medium) | |||
A-83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788-5MG | 500 nM |
B27 Supplement (50X) | Gibco | 17504-001 | 1X |
[Leu15]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145-.5MG | 10 nM |
Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | 50 ng/mL |
Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | 100 ng/mL |
N-Acetyl-L-cysteine | MP Biomedicals | 194603 | 1 mM |
N-2 MAX Media Supplement (100X) | R&D Systems | AR009 | 1X |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | 10 mM |
Noggin Conditioned Medium | n/a | n/a | 10 vol/vol % |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | 100 µg/mL |
R-Spondin-1 Conditioned Medium | n/a | n/a | 20 vol/vol % |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | 10 µM |
Monolayer Culture Medium (Supplements to Organoid Culture Medium) | |||
CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046-5MG | 2.5 µM |
HI FBS | Gibco | 10438-034 | 20 vol/vol % |
LY2157299 | Sigma-Aldrich | SML2851-5MG | 500 nM |
Y-27632 | StemCellTechnologies | 72308 | 10 µM |
Reagents | |||
Alexa Fluor 488 Mouse anti-E-cadherin | BD Biosciences | 560061 | 1:200 dilution |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | 1:400 dilution |
BSA | Cytiva | SH30574.02 | 2 w/vol % |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | n/a |
DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | 1:1000 dilution |
DPBS (1X) | Gibco | 14190-144 | n/a |
Fluorescein Isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | FD4-100MG | 0.5 mg/mL |
Matrigel Matrix | Corning | 354234 | n/a |
Paraformaldehyde Solution (4%) | Thermo Scientific | J19943K2 | n/a |
ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | n/a |
SNA, EBL, Fluorescein | Vector Laboratories | FL-1301 | 1:100 dilution |
Triton X-100 | Thermo Scientific | A16046.AE | 0.3 vol/vol % |
TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | n/a |
Trypan Blue Solution, 0.4% | VWR Life Science | K940-100ML | n/a |
Materials and Equipment | |||
0.4 µm Cell Culture Insert | Falcon | 353095 | |
24-well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | |
48-well Cell Culture Plate | Thermo Scientific | 150687 | |
70 µm Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One | 655086 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5910Ri | |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 370 | |
Epithelial Volt-Ohm Meter | Millipore | Millicell ERS-2 | |
Hemocytometer | LW Scientific | CTL-HEMM-GLDR | |
Inverted Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP8-X | |
Inverted Phase-Contrast Microscope | Leica Microsystems | DMi1 | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-540-B | |
Microplate Reader | Molecular Devices | SpecrtraMax i3x | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-034-486 | |
Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
Scalpel Blade | iMed Scientific | – | #11 carbon steel |
Vortex Mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
Software | |||
LAS X imaging software | Leica Microsystems | LAS X 3.7.6.25997 | |
Microplate Reader software | Molecular Devces | SoftMax Pro 7.1.2 |