La barrera hematoencefálica es un obstáculo importante en la administración de terapias para el glioblastoma, una enfermedad para la que no hay cura. Aquí, reportamos una nano plataforma terapéutica de óxido de hierro guiada por imágenes in vivo que puede eludir esta barrera fisiológica en virtud de su tamaño y acumularse en el tumor.
El glioblastoma multiforme (GBM) es la forma más común y agresiva de neoplasia maligna cerebral primaria para la cual no existe cura. La barrera hematoencefálica es un obstáculo importante en la administración de terapias para el GBM. Aquí se informa de una nanoplataforma de administración terapéutica basada en óxido de hierro guiada por imágenes capaz de eludir esta barrera fisiológica en virtud de su tamaño y acumularse en la región tumoral, entregando su carga útil. Esta nanoplataforma de 25 nm consta de nanopartículas de óxido de hierro recubiertas de dextrano reticuladas marcadas con colorante fluorescente Cy5.5 y que contienen oligonucleótidos antisentido como carga útil. El núcleo magnético de óxido de hierro permite el seguimiento de las nanopartículas a través de imágenes de resonancia magnética in vivo , mientras que el colorante Cy5.5 permite el seguimiento mediante imágenes ópticas. Este informe detalla el seguimiento de la acumulación de esta plataforma de nanopartículas (denominada MN-anti-miR10b) en tumores de glioblastoma implantados ortotópicamente después de una inyección intravenosa. Además, proporciona información sobre la administración in vivo de oligonucleótidos de ARN, un problema que ha dificultado la traducción de las terapias de ARN a la clínica.
El glioblastoma multiforme (GBM) es el grado más alto de astrocitoma para el que prácticamente no hay cura. Aproximadamente 15.000 personas son diagnosticadas con glioblastoma anualmente, que tiene una mediana de supervivencia pésima de aproximadamente 15 meses y una tasa de supervivencia a 5 años del 5%1. En las últimas décadas, ha habido una mejora marginal en el pronóstico a pesar de los múltiples esfuerzos para avanzar en las opciones terapéuticas. El estándar actual de atención para la GBM incluye la resección quirúrgica máxima, cuando sea posible, seguida de radioterapia y quimioterapia2. La temozolomida (TMZ), la quimioterapia de elección, fue la última terapia para el glioblastoma que mostró una eficacia clínica notable; sin embargo, al menos el 50% de los tumores GBM muestran resistencia a TMZ3. A pesar de este riguroso régimen terapéutico, todavía existe una necesidad clínica significativa de mejorar el tratamiento del glioblastoma.
El desarrollo de terapias para el GBM y otras enfermedades relacionadas con el cerebro se ve obstaculizado significativamente por la naturaleza selectiva de la barrera hematoencefálica (BBB). La BHE es una barrera fisiológica compuesta por células endoteliales, pericitos y extremos de los pies de los astrocitos, que crea la membrana semipermeable entre el sistema circulatorio y el cerebro, restringiendo el libre paso de moléculas y células al cerebro4. Si bien es protector en la fisiología normal y crítico para la homeostasis cerebral, la BHE impide que muchas terapias lleguen al cerebro, lo que complica el tratamiento de la MBG. Los esfuerzos para mejorar la administración de terapias para GBM han llevado al desarrollo de vehículos de administración basados en nanopartículas, la mejora de la administración de fármacos por ultrasonido focalizado y la administración de fármacos mediada por receptores 5,6.
Las nanopartículas se han convertido en un medio prometedor para el desarrollo de terapias para una gran variedad de enfermedades, incluidos los cánceres. La aplicación de nanopartículas con fines imagenológicos y terapéuticos en GBM se ha intentado utilizando varias construcciones de nanopartículas 7,8. Con el enfoque en la administración de fármacos a GBM junto con la obtención de imágenes in vivo de la administración, el enfoque propuesto utiliza nanopartículas magnéticas (MN) que consisten en un núcleo de óxido de hierro y están cubiertas por dextrano para su estabilidad. Las propiedades magnéticas de estas nanopartículas permiten su detección por resonancia magnética (RM), mientras que la química de conjugación simple con el recubrimiento de dextrano aminado permite la conjugación de fracciones terapéuticas como moléculas de ARN, fracciones de focalización adicionales o fracciones de imagen (como el colorante óptico de infrarrojo cercano Cy5.5)9,10. Además de las capacidades de imagen, la nanoplataforma es capaz de prolongar la vida media de las terapias de ARN protegiendo el oligonucleótido de las nucleasas endógenas, mejorando la administración terapéutica. Aquí, se presenta la aplicación de esta nano plataforma para la administración in vivo de oligonucleótidos terapéuticos (denominados MN-anti-miR10b) a GBM, monitoreados por imágenes in vivo. Anteriormente, se demostró la capacidad de esta nanoplataforma para acumularse en células GBM in vitro, causando una pérdida significativa de viabilidad de las células tumorales11. Antes de realizar estudios terapéuticos in vivo, es necesario demostrar la entrega in vivo de esta nanoplataforma a los tumores GBM en modelos animales. Para lograr esto, se produjeron modelos animales ortotópicos de GBM, y se realizó la administración intravenosa del constructo seguida de imágenes in vivo. A continuación se describen los protocolos de estos estudios que muestran la acumulación en la región tumoral confirmada por imágenes in vivo y microscopía ex vivo.
Varios pasos críticos en los diferentes métodos de validación de la acumulación de las nanopartículas en la BBB pueden ser decisivos para el éxito del protocolo. A partir de la implantación ortotópica de células GBM, es importante asegurarse de que las líneas de sutura del cráneo sean visibles después de secar el hueso; Esto ayuda a la colocación precisa de las células tumorales. Para perforar el cráneo, es mejor aplicar una ligera presión en el sitio de perforación y co…
The authors have nothing to disclose.
El financiamiento para este estudio fue proporcionado en parte por la subvención de la Alianza de Ciencias de la Salud de la Universidad Estatal de Michigan Henry Ford Health Systems a A.M. y A.dC. Agradecemos a la Dra. Danielle R. Ferguson por supervisar los estudios con animales en la Universidad Estatal de Michigan y por aprobar este video.
Athymic nude "J:NU" mice | Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:007850 | Immunocompromised mouse model |
0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Cell culture reagent for U251 |
1.7 mL microcentrifuge tube | DOT Scientific | RN1700-GMT | For tissue collection |
10 µL, Neuros Syringe, Model 1701 RN, 33 gauge, Point Style 4 | Hamilton | 65460-06 | Syringe for intracranial implantation of tumor cells |
3M Vetbond | 3M | 1469SB | Tissue adhesive for surgical site closure |
4% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | J199943-K2 | Tissue fixing solution |
70% isopropoyl alcohol wipe | Cardinal | MW-APL | Topical antiseptic wipe for tumor implantation and tail vein injection |
Aperio Versa | Leica | For scanning of stained tissue section slides | |
Betadine Surgical Scrub | Purdue | 6761815101 | Topical antiseptic for tumor implantation |
BioSpec 70/30 | Bruker | Magnetic resonance imaging scanner | |
Bone Wax | Medline | DYNJBW25 | Bone wax for sealing implantation site |
Burrs for Micro drill | F.S.T. | 19007-05 | Drill burr used to make hole in skull for tumor implantation |
DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | Tissue mounting media containing DAPI stain |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | Cell culture media for U251 |
Extra Fine Graefe Forceps | F.S.T. | 11150-10 | Sugical tool for tumor implantation |
Fetal bovine serum | Corning | 35-010-CV | Cell culture media supplement for U251 |
Fine Scissors – Sharp 10.5cm | F.S.T. | 14060-10 | Sugical tool for tumor implantation |
Glydo (Lidocaine) | Sagent | 673-76 | Topical analgesic for surgical site |
Ideal Micro Drill | CellPoint Scientific | 67-1200A | Drill used to make hole in skull for tumor implantation |
Insulin syringe 1CC 29G X 1/2" | Becton, Dickinson | 324704 | Syringe for D-Luciferin injection and tail vein injection of nanoparticles |
Isoflurane | Covetrus | 11695067772 | Anethesia |
Isoflurane vaporizer | SOMNI Scientific | VS6002 | Anethesia apparatus |
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System | PerkinElmer/Revvity | 128201 | Bioluminescence and fluorescence imaging scanner |
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt | PerkinElmer/Revvity | 122799-100MG | Substrate for bioluminescence imaging |
Ketaset (Ketamine) | Zoetis | 10004027 | Anesthetic for tumor implantation surgery |
Ketofen (Ketoprofen) | Zoetis | 10004031 | Analgesic for tumor implantation surgery |
Leica CM1950 | Leica | CM1950 | For cryosectioning of OCT-embedded samples |
PBS | Gibco | 14190-144 | Cell culture reagent and cell suspension solution for implantation of U251 |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotic for cell culture media for U251 |
Puralube vet ointment | MWI Veterinary | 27505 | Opthalmic eye ointment for protection during tumor implantation |
Ruler | F.S.T. | 18000-30 | Used to measure drill site for implanation |
Tissue-Tek Cryomold Intermediate 15 x 15 x 5 mm | Sakura | 4566 | Collection mold for collecting tissue samples |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | Freezing compound for collecting tissue samples |
U-251 MG cell line human | Millapore Sigma | 9063001 | Human glioblastoma cell line |
Xylazine Injectable Solution, 100 mg/ml | Covetrus | 1XYL006 | Paralytic for tumor implantation surgery |