Summary

Entrega de nanopartículas de una carga útil de oligonucleótidos en un modelo animal de glioblastoma multiforme

Published: September 27, 2024
doi:

Summary

La barrera hematoencefálica es un obstáculo importante en la administración de terapias para el glioblastoma, una enfermedad para la que no hay cura. Aquí, reportamos una nano plataforma terapéutica de óxido de hierro guiada por imágenes in vivo que puede eludir esta barrera fisiológica en virtud de su tamaño y acumularse en el tumor.

Abstract

El glioblastoma multiforme (GBM) es la forma más común y agresiva de neoplasia maligna cerebral primaria para la cual no existe cura. La barrera hematoencefálica es un obstáculo importante en la administración de terapias para el GBM. Aquí se informa de una nanoplataforma de administración terapéutica basada en óxido de hierro guiada por imágenes capaz de eludir esta barrera fisiológica en virtud de su tamaño y acumularse en la región tumoral, entregando su carga útil. Esta nanoplataforma de 25 nm consta de nanopartículas de óxido de hierro recubiertas de dextrano reticuladas marcadas con colorante fluorescente Cy5.5 y que contienen oligonucleótidos antisentido como carga útil. El núcleo magnético de óxido de hierro permite el seguimiento de las nanopartículas a través de imágenes de resonancia magnética in vivo , mientras que el colorante Cy5.5 permite el seguimiento mediante imágenes ópticas. Este informe detalla el seguimiento de la acumulación de esta plataforma de nanopartículas (denominada MN-anti-miR10b) en tumores de glioblastoma implantados ortotópicamente después de una inyección intravenosa. Además, proporciona información sobre la administración in vivo de oligonucleótidos de ARN, un problema que ha dificultado la traducción de las terapias de ARN a la clínica.

Introduction

El glioblastoma multiforme (GBM) es el grado más alto de astrocitoma para el que prácticamente no hay cura. Aproximadamente 15.000 personas son diagnosticadas con glioblastoma anualmente, que tiene una mediana de supervivencia pésima de aproximadamente 15 meses y una tasa de supervivencia a 5 años del 5%1. En las últimas décadas, ha habido una mejora marginal en el pronóstico a pesar de los múltiples esfuerzos para avanzar en las opciones terapéuticas. El estándar actual de atención para la GBM incluye la resección quirúrgica máxima, cuando sea posible, seguida de radioterapia y quimioterapia2. La temozolomida (TMZ), la quimioterapia de elección, fue la última terapia para el glioblastoma que mostró una eficacia clínica notable; sin embargo, al menos el 50% de los tumores GBM muestran resistencia a TMZ3. A pesar de este riguroso régimen terapéutico, todavía existe una necesidad clínica significativa de mejorar el tratamiento del glioblastoma.

El desarrollo de terapias para el GBM y otras enfermedades relacionadas con el cerebro se ve obstaculizado significativamente por la naturaleza selectiva de la barrera hematoencefálica (BBB). La BHE es una barrera fisiológica compuesta por células endoteliales, pericitos y extremos de los pies de los astrocitos, que crea la membrana semipermeable entre el sistema circulatorio y el cerebro, restringiendo el libre paso de moléculas y células al cerebro4. Si bien es protector en la fisiología normal y crítico para la homeostasis cerebral, la BHE impide que muchas terapias lleguen al cerebro, lo que complica el tratamiento de la MBG. Los esfuerzos para mejorar la administración de terapias para GBM han llevado al desarrollo de vehículos de administración basados en nanopartículas, la mejora de la administración de fármacos por ultrasonido focalizado y la administración de fármacos mediada por receptores 5,6.

Las nanopartículas se han convertido en un medio prometedor para el desarrollo de terapias para una gran variedad de enfermedades, incluidos los cánceres. La aplicación de nanopartículas con fines imagenológicos y terapéuticos en GBM se ha intentado utilizando varias construcciones de nanopartículas 7,8. Con el enfoque en la administración de fármacos a GBM junto con la obtención de imágenes in vivo de la administración, el enfoque propuesto utiliza nanopartículas magnéticas (MN) que consisten en un núcleo de óxido de hierro y están cubiertas por dextrano para su estabilidad. Las propiedades magnéticas de estas nanopartículas permiten su detección por resonancia magnética (RM), mientras que la química de conjugación simple con el recubrimiento de dextrano aminado permite la conjugación de fracciones terapéuticas como moléculas de ARN, fracciones de focalización adicionales o fracciones de imagen (como el colorante óptico de infrarrojo cercano Cy5.5)9,10. Además de las capacidades de imagen, la nanoplataforma es capaz de prolongar la vida media de las terapias de ARN protegiendo el oligonucleótido de las nucleasas endógenas, mejorando la administración terapéutica. Aquí, se presenta la aplicación de esta nano plataforma para la administración in vivo de oligonucleótidos terapéuticos (denominados MN-anti-miR10b) a GBM, monitoreados por imágenes in vivo. Anteriormente, se demostró la capacidad de esta nanoplataforma para acumularse en células GBM in vitro, causando una pérdida significativa de viabilidad de las células tumorales11. Antes de realizar estudios terapéuticos in vivo, es necesario demostrar la entrega in vivo de esta nanoplataforma a los tumores GBM en modelos animales. Para lograr esto, se produjeron modelos animales ortotópicos de GBM, y se realizó la administración intravenosa del constructo seguida de imágenes in vivo. A continuación se describen los protocolos de estos estudios que muestran la acumulación en la región tumoral confirmada por imágenes in vivo y microscopía ex vivo.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Michigan (IACUC). Se compraron ratones hembra exogados desnudos atímicos de Jackson Labs (cepa #007850) a las 7 semanas de edad y se les permitió aclimatarse durante 1 semana antes de la cirugía de implantación. Los ratones pesaban aproximadamente 21-25 g en el momento del implante. Las células U251 que expresan luciferasa de luci…

Representative Results

Se sintetizó y caracterizó MN-anti-miR10b, como se describió anteriormente11. La microscopía electrónica de transmisión de MN-anti-miR10b muestra la morfología y polidispersidad de la nanoplataforma (Figura 1B). Esta nanoplataforma tiene un tamaño promedio de 25,12 ± 0,34 nm con un potencial zeta de 13,18 ± 1,47 mV (Figura 1C,D). En estos estudios, se implantaro…

Discussion

Varios pasos críticos en los diferentes métodos de validación de la acumulación de las nanopartículas en la BBB pueden ser decisivos para el éxito del protocolo. A partir de la implantación ortotópica de células GBM, es importante asegurarse de que las líneas de sutura del cráneo sean visibles después de secar el hueso; Esto ayuda a la colocación precisa de las células tumorales. Para perforar el cráneo, es mejor aplicar una ligera presión en el sitio de perforación y co…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El financiamiento para este estudio fue proporcionado en parte por la subvención de la Alianza de Ciencias de la Salud de la Universidad Estatal de Michigan Henry Ford Health Systems a A.M. y A.dC. Agradecemos a la Dra. Danielle R. Ferguson por supervisar los estudios con animales en la Universidad Estatal de Michigan y por aprobar este video.

Materials

Athymic nude "J:NU" mice Jackson Laboratory RRID:IMSR_JAX:007850 Immunocompromised mouse model
0.25% Trypsin Gibco 25200-056 Cell culture reagent for U251
1.7 mL microcentrifuge tube DOT Scientific RN1700-GMT For tissue collection
10 µL, Neuros Syringe, Model 1701 RN, 33 gauge, Point Style 4 Hamilton 65460-06 Syringe for intracranial implantation of tumor cells
3M Vetbond 3M 1469SB Tissue adhesive for surgical site closure
4% Paraformaldehyde  Thermo Scientific J199943-K2 Tissue fixing solution
70% isopropoyl alcohol wipe Cardinal MW-APL Topical antiseptic wipe for tumor implantation and tail vein injection
Aperio Versa Leica For scanning of stained tissue section slides
Betadine Surgical Scrub Purdue 6761815101 Topical antiseptic for tumor implantation
BioSpec 70/30 Bruker Magnetic resonance imaging scanner
Bone Wax Medline DYNJBW25 Bone wax for sealing implantation site
Burrs for Micro drill F.S.T. 19007-05 Drill burr used to make hole in skull for tumor implantation
DAPI Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20 Tissue mounting media containing DAPI stain
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11995-065 Cell culture media for U251
Extra Fine Graefe Forceps F.S.T. 11150-10 Sugical tool for tumor implantation
Fetal bovine serum Corning 35-010-CV Cell culture media supplement for U251
Fine Scissors – Sharp 10.5cm F.S.T. 14060-10 Sugical tool for tumor implantation
Glydo (Lidocaine) Sagent 673-76 Topical analgesic for surgical site
Ideal Micro Drill CellPoint Scientific 67-1200A Drill used to make hole in skull for tumor implantation
Insulin syringe 1CC 29G X 1/2" Becton, Dickinson 324704 Syringe for D-Luciferin injection and tail vein injection of nanoparticles
Isoflurane Covetrus 11695067772 Anethesia
Isoflurane vaporizer SOMNI Scientific VS6002 Anethesia apparatus
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System PerkinElmer/Revvity 128201 Bioluminescence and fluorescence imaging scanner
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt PerkinElmer/Revvity 122799-100MG Substrate for bioluminescence imaging
Ketaset (Ketamine) Zoetis 10004027 Anesthetic for tumor implantation surgery
Ketofen (Ketoprofen) Zoetis 10004031 Analgesic for tumor implantation surgery
Leica CM1950 Leica CM1950 For cryosectioning of OCT-embedded samples
PBS Gibco 14190-144 Cell culture reagent and cell suspension solution for implantation of U251
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122 Antibiotic for cell culture media for U251
Puralube vet ointment MWI Veterinary 27505 Opthalmic eye ointment for protection during tumor implantation
Ruler F.S.T. 18000-30 Used to measure drill site for implanation
Tissue-Tek Cryomold  Intermediate 15 x 15 x 5 mm Sakura 4566 Collection mold for collecting tissue samples
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura 4583 Freezing compound for collecting tissue samples
U-251 MG cell line human Millapore Sigma 9063001 Human glioblastoma cell line
Xylazine Injectable Solution, 100 mg/ml Covetrus 1XYL006 Paralytic for tumor implantation surgery

Referencias

  1. Tan, A. C., et al. Management of glioblastoma: State of the art and future directions. CA Cancer J Clin. 70 (4), 299-312 (2020).
  2. Cihoric, N., et al. Current status and perspectives of interventional clinical trials for glioblastoma – analysis of clinicaltrials.Gov. Radiat Oncol. 12 (1), 1 (2017).
  3. Lee, S. Y. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes Dis. 3 (3), 198-210 (2016).
  4. Dong, X. Current strategies for brain drug delivery. Theranostics. 8 (6), 1481-1493 (2018).
  5. Teleanu, D. M., Chircov, C., Grumezescu, A. M., Volceanov, A., Teleanu, R. I. Blood-brain delivery methods using nanotechnology. Pharmaceutics. 10 (4), 268 (2018).
  6. Ohta, S., et al. Investigating the optimum size of nanoparticles for their delivery into the brain assisted by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Sci Rep. 10 (1), 18220 (2020).
  7. Teplyuk, N. M., et al. Therapeutic potential of targeting microrna-10b in established intracranial glioblastoma: First steps toward the clinic. EMBO Mol Med. 8 (3), 268-287 (2016).
  8. Dube, T., Kumar, N., Bishnoi, M., Panda, J. J. Dual blood-brain barrier-glioma targeting peptide-poly(levodopamine) hybrid nanoplatforms as potential near infrared phototheranostic agents in glioblastoma. Bioconjug Chem. 32 (9), 2014-2031 (2021).
  9. Yoo, B., et al. Design of nanodrugs for mirna targeting in tumor cells. J Biomed Nanotechnol. 10 (6), 1114-1122 (2014).
  10. Medarova, Z., Pham, W., Farrar, C., Petkova, V., Moore, A. In vivo imaging of sirna delivery and silencing in tumors. Nature Medicine. 13 (3), 372-377 (2007).
  11. Chen, M., et al. Co-administration of temozolomide (tmz) and the experimental therapeutic targeting mir-10b, profoundly affects the tumorigenic phenotype of human glioblastoma cells. Front Mol Biosci. 10, 1179343 (2023).
  12. Irtenkauf, S. M., et al. Optimization of glioblastoma mouse orthotopic xenograft models for translational research. Compar Med. 67 (4), 300-300 (2017).
  13. Moore, A., Marecos, E., Bogdanov, A., Weissleder, R. Tumoral distribution of iron oxide nanoparticles in a rodent model. Radiology. 214 (2), 568-574 (2000).
  14. Moore, A., Medarova, Z., Potthast, A., Dai, G. In vivo targeting of underglycosylated muc-1 tumor antigen using a multimodal imaging probe. Cancer Res. 64 (5), 1821-1827 (2004).
  15. Yoo, B., et al. Therapy targeted to the metastatic niche is effective in a model of stage iv breast cancer. Sci Rep. 7, 45060 (2017).
  16. Dadfar, S. M., et al. Iron oxide nanoparticles: Diagnostic, therapeutic and theranostic applications. Adv Drug Deliv Rev. 138, 302-325 (2019).

Play Video

Citar este artículo
Kim, B. D., Mondal, S. K., Kenyon, E., Chen, M., Mallett, C. L., deCarvalho, A. C., Medarova, Z., Moore, A. Nanoparticle Delivery of an Oligonucleotide Payload in a Glioblastoma Multiforme Animal Model. J. Vis. Exp. (211), e66986, doi:10.3791/66986 (2024).

View Video