La electroporación de sustratos porosos (PSEP) combina una entrega consistente y de alto rendimiento con una alta viabilidad de celda. La introducción de las mediciones de impedancia eléctrica transepitelial (TEEI) proporciona información sobre los procesos intermedios de PSEP y permite la entrega sin etiquetas. Este artículo discute un método para realizar experimentos de entrega de PSEP y análisis de medición TEEI simultáneamente.
La electroporación de sustrato poroso (PSEP) es un método emergente de electroporación que proporciona un alto rendimiento y una entrega constante. Al igual que muchos otros tipos de administración intracelular, la PSEP depende en gran medida de los marcadores fluorescentes y la microscopía fluorescente para determinar el éxito de la administración. Para obtener información sobre los pasos intermedios del proceso de electroporación, se desarrolló una plataforma PSEP con monitoreo integrado de impedancia eléctrica transepitelial (TEEI). Las células se cultivan en insertos disponibles comercialmente con membranas porosas. Después de un período de incubación de 12 h para permitir la formación de una monocapa celular completamente confluente, los insertos se colocan en medios de transfección ubicados en los pocillos del dispositivo PSEP. A continuación, las monocapas celulares se someten a una forma de onda definida por el usuario y la eficiencia de la entrega se confirma mediante microscopía fluorescente. Este flujo de trabajo se puede mejorar significativamente con mediciones TEEI entre microscopía pulsante y fluorescente para recopilar datos adicionales sobre el proceso PSEP, y estos datos adicionales de TEEI se correlacionan con métricas de entrega, como la eficiencia y la viabilidad de la entrega. Este artículo describe un protocolo para realizar PSEP con mediciones TEEI.
La electroporación es una técnica en la que las células se exponen a un campo eléctrico, creando poros temporales en la membrana celular a través de los cualespueden pasar las cargas, incluidas las proteínas, el ARN y el ADN. La versión más utilizada es la electroporación a granel (BEP). La BEP se realiza llenando una cubeta con un electrolito que contiene millones de células, exponiendo el electrolito a alto voltaje y permitiendo que la carga entre en las células a través de la difusión oendocitosis. El BEP tiene muchas ventajas, como el alto rendimiento y los numerosos sistemas disponibles en el mercado. Sin embargo, existen limitaciones en la entrega de BEP. El posicionamiento inconsistente de la celda en relación con los electrodos y el blindaje del campo eléctrico de las celdas adyacentes causan una variabilidad significativa en la exposición al campo eléctrico durante BEP 3,4. El alto voltaje requerido para BEP también tiene un impacto negativo significativo en la viabilidad de la celda5. Desde su creación en 20116, ha habido un creciente interés en un método de electroporación llamado electroporación de sustrato poroso (PSEP), aunque a veces se le conoce con otros nombres, como electroporación localizada y nano o microelectroporación 1,7,8. A diferencia de la suspensión celular de BEP, la PSEP se lleva a cabo en células que se adhieren a un sustrato poroso. No solo se prefiere un estado adherente para la mayoría de las líneas celulares humanas9, sino que los poros del sustrato también se centran en la corriente eléctrica, localizando el potencial eléctrico transmembrana (TMP) en regiones específicas de la membrana celular10,11. Esta localización permite una reducción significativa en el voltaje aplicado, disminuyendo el daño y aumentando la viabilidad de la celda. Esta combinación de efectos ayuda a controlar el desarrollo de los poros de la membrana celular, lo que resulta en una entrega más consistente y eficiente 1,5,12.
Un estudio reciente introdujo un dispositivo PSEP con una guía de electrodos chapada en oro de seis pocillos para sostener insertos de membrana porosa disponibles comercialmente13 (Figura 1A,B), una práctica que fue introducida por primera vez por Vindis et al.14. El dispositivo puede aplicar pulsos y medir la impedancia eléctrica a través de la monocapa de la célula, conocida como impedancia eléctrica transepitelial (TEEI), en tiempo real13. La interfaz de usuario del dispositivo permite un control completo sobre la forma de onda y la polaridad de la electroporación. Es importante destacar que las mediciones de impedancia en tiempo real se pueden utilizar para predecir los resultados de la entrega sin la necesidad de reactivos costosos o marcadores fluorescentes, un concepto conocido como administración sin etiquetas15.
La plataforma PSEP consta de dos componentes eléctricos principales personalizados: el cuerpo principal del dispositivo, que alberga el generador de pulsos y el equipo de medición TEEI, y la guía de electrodos, donde se insertan los sustratos porosos y se produce la electroporación. Los diagramas para todos los componentes electrónicos personalizados e impresos en 3D se pueden encontrar en GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI. Además de la electrónica personalizada, también se requiere una computadora para que la plataforma funcione correctamente. El software personalizado requiere MATLAB (versión 2021a o posterior) para ejecutarse y Microsoft Excel para almacenar y acceder a los datos para su análisis. El programa controla la electrónica personalizada y proporciona la interfaz gráfica de usuario (GUI) para ajustar la configuración. Estos programas también estuvieron disponibles en GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI.
Los datos preliminares sugieren que este proceso es posible para diferentes tipos de células adherentes (Figura 1C), pero en este artículo solo se discutirá la preparación de células A431 utilizando parámetros que Brooks et al.13 encontraron óptimos para esta línea celular. Además, debido a que la carga de yoduro de propidio (PI) es citotóxica, se realizan dos experimentos, el primero con un medio de transfección de PI de alta concentración para cuantificar la eficiencia de la entrega, y el segundo con solo medios de cultivo celular para medir TEEI en escalas de tiempo más largas. Estos experimentos utilizan formas de onda de electroporación idénticas, lo que permite correlacionar los resultados (Figura 1D).
Figura 1: Diagrama de ensamblaje de la guía de electrodos y datos fundamentales. (A) Modelo CAD de un inserto dentro de un pocillo de la guía de electrodos. (B) Modelo CAD de la guía de electrodos. (C) Aumento de impedancia debido a PSEP para líneas celulares seleccionadas, n = 3 por línea celular. Barra de error: error estándar de la media. (D) Eficiencia de entrega vs. TEEI aumentar los datos de correlación. La eficiencia de la entrega se calculó dividiendo el número de células marcadas en las imágenes de PI y calceína de los experimentos de entrega por el número total de células identificadas con Hoechst. El recuento de células se determinó utilizando una canalización CellProfiler personalizada, n = 6 por voltaje. Barra de error: (eje x e y) error estándar de la media. Esta figura se reproduce de Brooks et al.13 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 2C demuestra que los aumentos de TEEI desde el mínimo y las disminuciones desde la línea de base se trazan para cada voltaje de forma de onda PSEP. El aumento del TEEI crea un arco parabólico, que alcanza un máximo de alrededor de 20 voltios antes de reducirse, mientras que la disminución del TEEI desde la línea de base aumenta exponencialmente a medida que aumenta el voltaje. La eficiencia de entrega y los porcentajes de muerte en la <strong…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos el apoyo financiero de la NSF (Premios 1826135, 1936065, 2143997), los Institutos Nacionales de Ciencias Médicas Generales de los NIH P20GM113126 (Centro de Comunicación Biomolecular Integrada de Nebraska) y P30GM127200 (Centro de Nanomedicina de Nebraska), la Iniciativa de Colaboración de Nebraska y el Apoyo de Bioingeniería Voelte-Keegan. El dispositivo fue fabricado en el Centro Central de Investigación de Nanoingeniería (NERCF), que está parcialmente financiado por la Iniciativa de Investigación de Nebraska.
15 mL Conical Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 339651 | |
2-Chip Disposable Hemocytometer | Bulldog Bio | DHC-N01 | |
75 cm2 Tissue Culture Flask | fisherbrand | FB012937 | |
A431 Cells | ATCC | CRL-1555 | |
Calcein AM | Invitrogen | C3099 | |
Class II Type A2 Biosafety Cabinet | Labgard | NU-543-600 | |
Custom Components | YangLab | https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI | |
Disposable Centrifuge Tube (50 mL) | fisherbrand | 05-539-6 | |
DMEM | Gibco | 11965092 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A5670401 | |
Fluid Aspiration System | vacuubrand | 20727403 | |
HERACELL 240i | Thermo Scientific | 51026331 | |
Hoechst 33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
Human Plasma Fibronectin | Sigma-Aldrich | FIBRP-RO | |
Inverted Fluorescent Microscope | Zeiss | 491916-0001-000 | |
Inverted Microscope | Labomed | TCM 400 | |
PBS | cytiva | SH30256.02 | |
PCR Tube 200 µL | Sarstedt | 72.737 | |
Penicillin / Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
Pipette (0.2-2 µL) | fisherbrand Elite | FBE00002 | |
Pipette (100-1000 µL) | fisherbrand Elite | FBE01000 | |
Pipette (20-200 µL) | fisherbrand Elite | FBE00200 | |
Pipette (2-20 µL) | fisherbrand Elite | FBE00020 | |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
Reaction Tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.300 | |
Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
Thincert (24-well) | Greiner Bio-One | 662 641 | 0.4 µm pore diameter, 2×106 cm-2 pore density, transparent PET |
Tissue Culture Plate (24-well) | fisherbrand | FB012929 | |
Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154-20mL | |
Trypsin | Gibco | 15090046 |