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Investigación sobre el cáncer

Évaluation de l’activité de réparation des cassures double brin de l’ADN à l’aide de dosages rapporteurs à haut débit et quantitatifs basés sur la luminescence

Published: June 14, 2024
doi:
10.3791/66969
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1Artios Pharma Ltd, Cambridge, 2The Francis Crick Institute, London

Summary

Nous présentons des protocoles pour l’évaluation de la compétence de la voie de réparation des cassures double brin dans les cellules à l’aide d’une série de substrats rapporteurs extrachromosomiques basés sur la luminescence.

Abstract

La réparation des cassures double brin de l’ADN (CDB) est cruciale pour le maintien de la stabilité du génome et de la viabilité cellulaire. La réparation des DSB (DSBR) dans les cellules est médiée par plusieurs mécanismes : la recombinaison homologue (HR), l’assemblage d’extrémités non homologues (NHEJ), l’assemblage d’extrémités médié par microhomologie (MMEJ) et le recuit simple brin (SSA). Les tests cellulaires sont essentiels pour mesurer la compétence et la modulation de ces voies en réponse à divers stimuli.

Ici, nous présentons une série de tests rapporteurs extrachromosomiques qui mesurent chacun la reconstitution d’un gène rapporteur de la nanoluciférase par l’une des quatre principales voies DSBR dans les cellules. Lors de la transfection transitoire dans les cellules d’intérêt, la réparation des substrats rapporteurs spécifiques à la voie peut être mesurée en moins de 24 heures par la détection de la luminescence de la nanoluciférase (NanoLuc).

Ces tests robustes sont quantitatifs, sensibles, titrables et se prêtent à un format de criblage à haut débit. Ces propriétés offrent de vastes applications dans la recherche sur la réparation de l’ADN et la découverte de médicaments, complétant la boîte à outils actuellement disponible de tests DSBR cellulaires.

Introduction

Les cassures double brin de l’ADN (CDB) représentent une classe particulièrement toxique de lésions de l’ADN1 en raison desquelles les cellules ont développé plusieurs voies de réparation des CDB (DSBR) pour réparer ces lésions. Les quatre principaux mécanismes DSBR sont la recombinaison homologue (HR), l’assemblage d’extrémités non homologues (NHEJ), l’assemblage d’extrémités médié par microhomologie (MMEJ) et le recuit monobrin (SSA)2,3. Les voies DSBR contribuent au maintien d’un développement tissulaire et d’une physiologie sains et protègent contre des maladies telles que le cancer. De plus, ces mécanismes de réparation présentent un potentiel thérapeutique pour le développement de modulateurs à petites molécules en oncologie de précision. Par exemple, le ciblage de l’ADN polymérase θ (Polθ), une enzyme pivot dans la voie de réparation de la MMEJ, a suscité de l’intérêt en raison de sa létalité synthétique avec déficit en HR dans le cancer4.

La compréhension du DSBR a donc de vastes implications cliniques et des tests cellulaires fonctionnels capables de mesurer l’activité de toutes les principales voies du DSBR sont nécessaires5. Les tests doivent être adaptés à la fois à l’interrogation génétique et pharmacologique et pouvoir être déployés dans des modèles cellulaires d’intérêt. Pour soutenir les efforts de découverte de médicaments à petites molécules, les tests doivent être très sensibles, titrables, avoir un délai d’exécution rapide et être évolutifs vers des formats à haut débit adaptés au criblage de composés.

En général, le DSBR a déjà été mesuré à l’aide de systèmes de dosage de rapporteurs basés sur la fluorescence et intégrés de manière stable dans le génome cellulaire6. Cependant, bien que la récapitulation physiologique du DSBR chromosomique soit un avantage certain, ces tests sont limités à un modèle hôte dans lequel le rapporteur est intégré, utilisent une préparation et une analyse d’échantillons à forte intensité de main-d’œuvre par cytométrie en flux, et ont un débit, un temps d’exécution, une robustesse et une sensibilité limités, toutes des caractéristiques essentielles nécessaires aux efforts de découverte de médicaments.

Nous décrivons ici une série de tests rapporteurs DSBR qui permettent d’évaluer les quatre principales voies DSBR. La série de substrats de test rapporteur est décrite à la figure 1 et décrite plus en détail dans une publication récente7. Ils sont extrachromosomiques, permettant leur introduction dans les cellules par simple transfection transitoire, et l’incorporation d’un gènerapporteur de nanoluciférase 8, qui doit être reconstitué en s’engageant avec des mécanismes spécifiques de DSBR, engendre sensibilité, robustesse et évolutivité. Les variantes de substrat rapporteur DSBR suivantes sont incluses dans le protocole (Figure 1) :

MMEJ indépendant de la résection : Ce substrat linéaire est composé d’une région centrale d’ADN double brin (ADNdb) avec des surplombs d’ADN simple brin (ADNsb), qui imitent les extrémités d’ADN réséquées9. Quatre microhomologies nucléotidiques aux extrémités des régions de l’ADNss codent pour le codon de départ du gène rapporteur. La réparation de ce substrat par MMEJ restaure le cadre de lecture ouvert du gène rapporteur (ORF).

MMEJ dépendant de la résection : L’exon du gène rapporteur N-terminal est interrompu par un segment contenant un codon stop, qui est flanqué de 8 microhomologies de paires de bases (pb). Une résection de l’extrémité nucléolytique est nécessaire avant la réparation médiée par MMEJ pour restaurer le gène rapporteur intact.

NHEJ émoussé : Le gène rapporteur est scindé en sections N- et C-terminales, dont cette dernière est placée en amont du promoteur. Le DSB est produit à l’aide d’EcoRV et nécessite une ligature directe (sans traitement d’extrémité) par le NHEJ pour que les parties du gène rapporteur soient réunies et que l’ORF rapporteur soit restauré.

NHEJ non émoussé : Le DSB est situé à l’intérieur d’un intron et aura des extrémités cohésives ou non cohésives selon le choix de l’enzyme de restriction. La réparation de ce substrat par NHEJ nécessite que la ligature soit précédée d’un traitement final.

Modèle long HR : L’exon N-terminal du gène rapporteur est interrompu par un segment d’ADN contenant des sites de restriction, qui remplacent 22 pb de la séquence originale du gène rapporteur. Pour restaurer cette séquence, la réparation par HR utilise le modèle d’homologie de 2,5 kilobases (kb) placé en aval de l’exon C-terminal.

Modèle court HR : Le site de restriction nécessaire pour générer le DSB remplace une partie de la séquence du gène rapporteur natif et introduit un codon stop dans le cadre. Comme la version à modèle long, ce substrat HR nécessite le modèle d’homologie en aval (360 pb) pour une réparation et une restauration précises de l’ORF rapporteur.

SSA: Ce substrat contient un codon stop prématuré situé dans l’exon N-terminal du gène rapporteur. L’ablation de ce codon stop et la réintégration de la séquence du gène rapporteur intact nécessitent une réparation par SSA, ce qui implique une résection bidirectionnelle à longue portée avant l’alignement des homologies.

Pour la génération de la DSB, certains des substrats rapporteurs peuvent être digérés avec I-SceI (Figure 1). Cela générera un substrat linéaire avec des extrémités non cohésives dans les rapporteurs MMEJ dépendants de la résection, NHEJ non émoussés, HR à modèle long et SSA, qui ont des sites I-SceI en tandem dans des orientations inversées. Dans le substrat rapporteur HR modèle court, la digestion du site unique I-SceI générera des extrémités cohésives. Les plasmides NHEJ non émoussés, MMEJ dépendants de la résection, HR à matrice longue et SSA peuvent également être digérés avec HindIII, ce qui produira des extrémités cohésives complémentaires.

Nous fournissons des protocoles pour la génération des substrats de test rapporteur et décrivons comment les tests peuvent être effectués, en fournissant des détails sur la façon dont ils peuvent être utilisés pour quantifier le DSBR, y compris les réponses titrables aux petites molécules, l’évaluation de la puissance cellulaire, l’activité sur la cible et la sélectivité des voies.

Protocol

1. Préparation et contrôle de la qualité (CQ) des substrats rapporteurs REMARQUE : Les plasmides codant pour les substrats rapporteurs peuvent être multipliés dans des souches standard d’Escherichia coli (p. ex., DH5α et dérivés) et récupérés par isolement plasmidique. Les détails du plasmide (taille et résistance aux antibiotiques) sont décrits dans le tableau 1 et la figure 1. Figure 1 : Schémas d’essais rapporteurs DSBR basés sur NanoLuc. Représentation schématique des substrats rapporteurs DSBR, y compris leur emplacement dans chaque plasmide source, les caractéristiques de la séquence principale et la disposition finale après réparation spécifique à la voie. Le noyau de substrat du MMEJ indépendant de la résection est excisé du plasmide source par digestion avec XhoI/HindIII, après quoi les capuchons doivent être ligaturés aux deux extrémités pour produire le substrat pour le MMEJ. Le substrat rapporteur émoussé de NHEJ est généré par excision à partir du plasmide source avec EcoRV. Les substrats rapporteurs MMEJ dépendant de la résection, NHEJ non émoussé, HR à matrice longue et SSA sont générés par linéarisation des plasmides sources à l’aide de I-SceI (qui produit des extrémités non cohésives) ou HindIII (qui produit des extrémités cohésives). Le substrat rapporteur HR à matrice courte est généré par linéarisation du plasmide source à l’aide de I-SceI (qui produit des extrémités cohésives). La réparation de chaque substrat rapporteur par la voie DSBR cible reconstitue une nanoluciférase ORF intacte codant pour la fonction NanoLuc. Cette figure a été adaptée de Rajendra et al.7. Abréviations : DSBR = réparation de rupture de brèche double brin ; NanoLuc = Nanoluciférase ; MMEJ = jonction d’extrémité médiée par microhomologie ; NHEJ = jonction d’extrémité non homologue ; HR = recombinaison homologue ; SSA = recuit monobrin ; ORF = cadre de lecture ouvert. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Préparation d’un substrat rapporteur MMEJ indépendant de la résection (Graphique 1 et Graphique 2A-C)Préparation des coiffes d’ADNsb/ADNdb (Figure 2A)Remettre en suspension les quatre oligonucléotides énumérés dans le tableau 2 individuellement dans un tampon de recuit (20 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl dans une eau de biologie moléculaire) pour générer une solution mère à 100 μM. Recuit des capuchons ss/dsDNAMélangez 50 μL chacun des oligonucléotides longs et courts (solution mère de 100 μM) pour le capuchon gauche de l’étape 1.1.1.1 dans un tube de 0,2 mL. Répétez l’opération pour les oligonucléotides du chapeau droit. À l’aide d’un thermocycleur, incuber chaque mélange d’oligonucléotides à 99 °C pendant 5 minutes, puis réduire à 10 °C à 1 °C/min.REMARQUE : Cela produira les capuchons gauche et droit recuits. (QC, facultatif) Vérification du recuit des oligonucléotides par électrophorèseÉlectrophorèse 100 ng de chaque produit de l’étape 1.1.1.2 avec des oligonucléotides individuels de l’étape 1.1.1.1 et une échelle d’ADN de faible poids moléculaire dans un gel d’acrylamide-Tris-Borate-EDTA (TBE) à 20 % à 200 V pendant 80 min. Teindre le gel avec un tampon TBE contenant un colorant d’ADN fluorescent approprié pour la visualisation de l’ADNsb et de l’ADNdb pendant au moins 10 à 15 min. Visualiser la fluorescence sur un système de documentation sur gel (Figure 2A).REMARQUE : Les étapes 1.1.1.3.1 à 1.1.1.3.3 sont utilisées pour vérifier que les capuchons ont été correctement recuits. Les tailles apparentes pour le capuchon gauche et le capuchon droit doivent être respectivement de ~120 pb et ~175 pb. Purification du noyau du substrat rapporteur (Figure 2B)Mélangez 100 μg du plasmide rapporteur avec 4 μL de HindIII et 4 μL de XhoI (4 U/μg de plasmide pour chaque enzyme) et 20 μL de tampon 10x. Porter le volume total à 200 μL avec de l’eau doublement distillée (ddH2O) et incuber à 37 °C pendant 2 h à toute la nuit pour digérer le plasmide.REMARQUE : Pour la digestion de quantités plus grandes ou plus petites, échelonnez la réaction proportionnellement. Incuber la réaction de digestion à 80 °C pendant 20 min pour inactiver la chaleur des enzymes de restriction. Ajouter 40 μL de phosphatase alcaline (plasmide 2 U/μg) et 27 μL de tampon 10x au mélange réactionnel de l’étape 1.1.2.2. Incuber à 37 °C pendant 2 h pour déphosphoryler le plasmide.REMARQUE : Augmentez ou diminuez la réaction selon vos besoins. Ajoutez 60 μL de colorant de chargement 6x à la réaction de l’étape 1.1.2.3. Électrophorèse associée à une échelle d’ADN de haut poids moléculaire dans un gel d’agarose-Tris-Acétate-EDTA (TAE) à 1,5 % (p/v) contenant une coloration fluorescente d’ADNdb à 120 V pendant 2,5 h ou jusqu’à ce que les bandes soient suffisamment résolues. Visualiser la fluorescence sur un système de documentation sur gel (Figure 2B). Exciser le fragment de noyau rapporteur (~1,5 kb) du gel à l’aide d’un scalpel propre, en prenant soin de ne pas contaminer avec le squelette vecteur (~2,5 kb). Extrayez le fragment de noyau rapporteur à l’aide d’un kit d’extraction de gel, en suivant les instructions du fabricant. Mesurer la concentration et la qualité de l’ADN (A260/280) par spectrophotométrie. Ligature du noyau du substrat rapporteur avec des capuchons d’ADNsb/ADNdb et purification du substrat rapporteur final (Figure 2C)Mélangez 30 μg du fragment de noyau rapporteur de l’étape 1.1.2.7 avec 3,85 μL de chaque capuchon gauche et droit recuit de l’étape 1.1.2 (rapport molaire d’environ 6:1 de l’ADN cap :noyau), 30 μL de tampon ligase 10x et 1,5 μL d’ADN ligase T4 (20 U/μg d’ADN). Porter le volume total de la réaction à 300 μL avec ddH2O et incuber pendant une nuit à 16 °C pour ligaturer les coiffes au fragment de noyau rapporteur.REMARQUE : Augmentez ou diminuez la réaction selon les besoins. (QC, facultatif) Électrophorèse 200 ng du produit résultant de l’étape 1.1.3.1 le long du noyau du substrat rapporteur et d’une échelle d’ADN de haut poids moléculaire dans un gel d’agarose-TAE à 0,7 % (p/v) contenant une coloration fluorescente d’ADNdb à 120 V pendant au moins 1,5 h. Vérifiez que la bande correspondant au produit ligaturé migre à un rythme légèrement plus lent que le noyau du substrat rapporteur non ligaturé (Figure 2C).REMARQUE : Cette étape de contrôle de la qualité consiste à vérifier que la ligature des capuchons au fragment de noyau rapporteur a eu lieu correctement. Purifier l’ADN de la réaction de digestion à l’étape 1.3.1. en utilisant la méthode préférée (p. ex., une méthode à base de billes ou de colonnes), en suivant les instructions du fabricant.REMARQUE : L’étape de purification 1.1.3.3 réduit considérablement la présence de bouchons non ligaturés. Mesure de la concentration et de la qualité de l’ADN (A260/280) par spectrophotométrie. Préparation du substrat rapporteur NHEJ émoussé (Figure 1 et Figure 2D,E)Mélangez 100 μg du plasmide du noyau rapporteur avec 5 μL d’EcoRV (plasmide 5 U/μg) et 20 μL de tampon 10x. Porter le volume total à 200 μL avec ddH2O et incuber à 37 °C pendant 2 h à toute la nuit pour digérer le plasmide.REMARQUE : Pour la digestion de quantités plus grandes ou plus petites, échelonnez la réaction proportionnellement. Incuber la réaction de digestion à 65 °C pendant 20 min pour inactiver la chaleur de l’enzyme de restriction. Ajoutez 50 μL de colorant de chargement 6x à la réaction de l’étape 1.2.2. Électrophorèse associée à une échelle d’ADN de haut poids moléculaire dans un gel d’agarose-TAE à 1,5 % (p/v) contenant une coloration fluorescente d’ADNdb à 120 V pendant 2 h ou jusqu’à ce que les bandes soient suffisamment résolues. Visualiser la fluorescence sur un système de documentation sur gel (Figure 2D). Exciser le substrat rapporteur (~1,7 kb) du gel à l’aide d’un scalpel propre, en prenant soin de ne pas contaminer avec le squelette du vecteur (~2,6 kb). Extraire le fragment de noyau rapporteur à l’aide d’un kit d’extraction sur gel, en suivant les instructions du fabricant (figure 2E). Mesurer la concentration et la qualité de l’ADN (A260/280) par spectrophotométrie. Préparation de substrats rapporteurs à base d’I-SCE I (Figure 1)REMARQUE : Ces substrats comprennent le MMEJ dépendant de la résection (figure 2F), le NHEJ non émoussé (figure 2G), le modèle long HR (figure 2H), le modèle court HR (figure 2I) et le SSA (figure 2J).Mélangez 100 μg du plasmide du noyau rapporteur avec 50 μL d’I-SceI (plasmide 5 U/μg) et 60 μL de tampon 10x. Porter le volume total à 600 μL avec ddH2O et incuber à 37 °C pendant 2 h à toute la nuit pour digérer le plasmide.REMARQUE : Pour la digestion de quantités plus grandes ou plus petites, échelonnez la réaction proportionnellement. Les plasmides NHEJ non émoussés, MMEJ dépendants de la résection, HR à matrice longue et SSA peuvent également être digérés avec HindIII, ce qui générera des extrémités cohésives complémentaires. Incuber la réaction de digestion à 65 °C pendant 20 min pour inactiver la chaleur I-SceI. Réglez la température à 80 °C pendant cette étape si HindIII a été utilisé pour la digestion à la place. Purifier l’ADN de la réaction de digestion inactivée à l’étape 1.3.2 à l’aide de la méthode privilégiée (p. ex., une méthode à base de billes ou à colonne), en suivant les instructions du fabricant. Mesure de la concentration et de la pureté de l’ADN (260/280) par spectrophotométrie. Contrôle de la qualité des substrats rapporteursÉlectrophorèse 200 ng du substrat rapporteur avec une échelle d’ADN de haut poids moléculaire dans un gel d’agarose-TAE à 0,7 % (p/v) contenant une coloration fluorescente d’ADNdb à 120 V pendant 2 h ou jusqu’à ce que les bandes soient suffisamment résolues. Chargez le plasmide rapporteur original non coupé à côté en tant que contrôle. Vérifier que les bandes définies de la bonne taille sont observées pour chaque substrat rapporteur (voir le Tableau 1 et la Figure 2F-J). Figure 2 : Analyses électrophorétiques sur gel de la génération de substrats rapporteurs DSBR. (A-C) Images représentatives de l’analyse électrophorétique sur gel des intermédiaires et de la construction finale requise pour la génération du substrat rapporteur MMEJ indépendant de la résection. Les images adjacentes dans les panneaux (A) et (C) proviennent des mêmes gels ; Les voies non pertinentes ont été omises. (D, E) Images représentatives de l’analyse électrophorétique sur gel pour le plasmide source, les produits digérés par EcoRV et la construction finale extraite par gel nécessaire à la génération du substrat rapporteur NHEJ émoussé. (F-J) Images représentatives de l’analyse électrophorétique sur gel de plasmides sources et de constructions DSBR linéarisées pour les substrats rapporteurs I-Sce I-Digested: MMEJ dépendant de la résection, NHEJ non émoussé, modèle long HR, modèle court HR, SSA. Abréviations : DSBR = réparation de rupture de brèche double brin ; MMEJ = jonction d’extrémité médiée par microhomologie ; NHEJ = jonction d’extrémité non homologue ; HR = recombinaison homologue ; SSA = recuit monobrin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 2. Transfection transitoire des substrats rapporteurs DSBR REMARQUE : La figure 3 donne un aperçu du déroulement expérimental des tests et de certaines permutations potentielles. Le protocole ci-dessous décrit une expérience utilisant des cellules HEK-293, où celles-ci sont transfectées inversement avec le substrat rapporteur. Les chiffres ci-dessous peuvent être augmentés ou réduits en fonction du nombre de puits à utiliser par plaque. Les étapes suivantes sont calculées pour un dosage effectué sur une plaque de 96 puits ; voir Discussion pour des considérations supplémentaires. Figure 3 : Flux de travail expérimental pour les dosages rapporteurs DSBR. Les cellules d’intérêt sont transfectées avec le substrat DSBR linéarisé (codant pour un ORF NanoLuc qui doit être réparé par un événement spécifique de réparation de l’ADN) et un plasmide Firefly (contrôle de transfection). Ensuite, 6 à 24 h après la transfection, la luminescence de Firefly et la luminescence de NanoLuc peuvent être lues séquentiellement après l’ajout de réactifs Nano-Glo Dual-Luciferase. Des exemples de permutations des étapes de base (illustrées dans des cases en bleu clair) peuvent être utilisés pour tester comment la modulation génétique (knockout, knockdown ou surexpression) ou le traitement pharmacologique affecte la compétence de la voie DSBR dans les cellules. Abréviations : DSBR = réparation de rupture de brèche double brin ; NanoLuc = Nanoluciférase ; WT = type sauvage ; KO = KO. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. (Facultatif) Si vous évaluez l’impact des composés sur l’essai rapporteur, distribuer les composés dissous dans le véhicule (p. ex., diméthylsulfoxyde [DMSO]) dans les puits d’une plaque de 96 puits selon un plan expérimental prédéfini. Normaliser la concentration des véhicules dans tous les puits.REMARQUE : Des répliques techniques sont recommandées. Inclure des puits de contrôle (p. ex., pour véhicules seulement). Dans un tube de 1,5 mL, diluer le plasmide témoin Firefly (luciférase témoin) et le substrat rapporteur DSBR de NanoLuc (luciférase rapporteure) générés aux étapes 1.1, 1.2 ou 1.3, dans 500 μL de tampon de transfection. Utiliser 0,66 μg de plasmide luciférase témoin pour 1 × 106 cellules. Voir le tableau 3 pour les quantités de substrat rapporteur NanoLuc DSBR à utiliser.REMARQUE : Un plasmide de contrôle positif qui exprime constitutivement la luciférase rapporteuse peut être utilisé pour valider la configuration de l’instrument et les conditions de transfection ou pour vérifier des effets non spécifiques sur la luciférase rapporteuse elle-même. Comme point de départ, nous recommandons 0,1 μg de plasmide rapporteur de luciférase et 0,66 μg de plasmide de contrôle de luciférase par 1 × 106 cellules. Ajouter un réactif de transfection à base de lipides à l’ADN dilué à partir de l’étape 2.2 selon le rapport recommandé par le fabricant (p. ex., 1:2, μg d’ADN :μL de réactif pour le réactif décrit dans le Tableau des matériaux), bien mélanger en utilisant brièvement le vortex et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Prélever des cellules par trypsinisation, les remettre en suspension dans un milieu frais contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et les compter. Transvasez 3 × 106 cellules dans un tube de 15 ml et mettez-les en suspension dans 8,5 ml de milieu. Ajoutez le mélange de transfection d’ADN de l’étape 2.3 dans la suspension cellulaire et mélangez plusieurs fois par inversion. Plaque de 80 μL de suspension cellulaire (environ 2,7 × 104 cellules) par puits.REMARQUE : La suspension contenant des cellules et le mélange de transfection d’ADN peut être distribuée sur la plaque soit par pipetage manuel, soit à l’aide d’un manipulateur de liquide automatisé pour des expériences à haut débit. Incuber à 37 °C/5% CO2 pendant 24 h. 3. Détection de la luminescence Préparation des réactifsSuivez les instructions du fabricant pour la préparation et l’ajout des réactifs de luciférase rapporteurs (NanoLuc) et de contrôle (Firefly), qui fournissent les substrats des deux luciférases (furimazine et 5′-fluoroluciférine, respectivement) : Préparez le réactif de contrôle luciférase. Reconstituer selon les instructions du fabricant et mélanger par inversion jusqu’à ce que le substrat de la luciférase soit complètement dissous. Préparez le réactif de luciférase rapporteur frais selon les instructions du fabricant. Calculer la quantité de réactif nécessaire pour ajouter 80 μL/puits et ajouter le substrat dans un volume approprié de tampon de dosage dans un rapport de 1:100 (substrat de luciférase :tampon). Pour une plaque à 96 puits, diluer 88 μL de substrat de luciférase dans 8 800 μL de tampon et mélanger par inversion.REMARQUE : Ces quantités comprennent un excédent d’environ 10%. Une fois reconstitué, le réactif de contrôle de la luciférase peut être stocké conformément aux instructions du fabricant pour une utilisation future. Le réactif rapporteur de luciférase doit être préparé frais pour chaque utilisation. Détection en série de luminescence à partir de luciférases de contrôle et de rapporteur (plaque à 96 puits)Laissez la plaque et les réactifs de luciférase atteindre la température ambiante. Ajouter 80 μL de réactif de contrôle luciférase par puits. Agitez la plaque pendant 3 min sur un agitateur orbital à 450 tr/min. Mesurez le signal de luminescence de la luciférase de contrôle à l’aide d’un lecteur de plaques de luminescence.REMARQUE : Lire l’émission à 580 nm (filtre passe-bande 80 nm) ou la luminescence totale par puits. Cette luminescence est utilisée comme mesure de l’efficacité de la transfection et de la densité cellulaire et peut également informer sur la toxicité cellulaire causée par les traitements d’essai. Ajouter 80 μL de réactif rapporteur luciférase par puits.REMARQUE : Ce réactif inhibera le contrôle luciférase ; Il contient également le substrat pour le rapporteur luciférase. Agitez la plaque pendant 3 min sur un agitateur orbital à 450 tr/min. Laisser reposer la plaque 7 min à température ambiante. Mesurez le signal de luminescence de la luciférase rapporteure à l’aide d’un lecteur de plaque de luminescence.REMARQUE : Émission de lecture à 470 nm (filtre passe-bande de 80 nm) ou, alternativement, luminescence totale par puits. Cette luminescence donne des informations sur la quantité de substrat rapporteur qui a été réparée par la voie DSBR d’intérêt. Exportez les relevés de luminescence pour l’analyse en aval. 4. Analyse des données Divisez le signal de luminescence de la luciférase rapporteure (NanoLuc) par le signal de luminescence de la luciférase de contrôle (Firefly) provenant du même puits pour calculer le signal de dosage. Appliquez ce calcul à tous les puits, comme le montre l’équation (1).(1) Calculer la moyenne des signaux d’analyse pour les puits de contrôle (p. ex., véhicule seulement). Normaliser les signaux d’analyse pour les puits d’essai en fonction de la moyenne du puits témoin à l’aide de l’équation (2) pour calculer le taux de réparation (%) par puits. (2) (En option, ajustement courbe) Si vous testez plusieurs doses de composé, tracez le taux de réparation calculé (%) en fonction de la concentration du composé et ajustez une courbe dose-réponse à l’aide d’un modèle de régression non linéaire. Utilisez cette courbe pour l’interpolation ultérieure de l’EC50 .

Representative Results

La réparation de chacun des dosages rapporteurs peut être détectée et quantifiée à l’aide de la même procédure. La réparation correcte d’un substrat par sa voie de réparation apparentée dans les cellules reconstituera un ORF intact et fonctionnel codant pour NanoLuc. Ce signal de luminescence peut être détecté à l’aide d’un lecteur de plaques. La co-transfection avec un plasmide intact codant pour la luciférase Firefly sert de contrôle de transfection. Ce contrôle a deux objectifs. Tout d’abord, il fournit une norme pour normaliser le signal NanoLuc, car il ne devrait pas être perturbé par la modulation du DSBR par des moyens génétiques ou pharmacologiques. Deuxièmement, il peut fournir une indication de perturbations cellulaires hors cible qui ont un impact sur le signal de la luciférase, telles que la modulation du cycle cellulaire, les effets sur la transcription/traduction ou la toxicité générale. Le rapport entre NanoLuc et Firefly sert de lecture de substitution de la réparation. Les valeurs de luminescence peuvent être exportées et analysées en normalisant les deux signaux de luciférase à l’intérieur du même puits. Dans le cas d’études de perturbation génétique (p. ex., comparaison d’ARNi de type sauvage et d’ARNi KO ou non ciblés et cibles), la réparation est généralement normalisée à l’échantillon parental (cellules de type sauvage ou cellules traitées avec des ARNi témoins non ciblés). Dans le cas de la modulation pharmacologique, les valeurs d’un échantillon traité par un composé sont normalisées à la valeur produite par le traitement par véhicule. La validation complète de la suite de rapports décrits a été récemment publiée7. Des données illustrant la caractérisation de la modulation génétique et pharmacologique de la DSBR sont présentées à la figure 4 (adaptée de 7). Polθ est le médiateur clé de la MMEJ et la perte ou l’inhibition de cette enzyme est prédite pour ablater spécifiquement la MMEJ cellulaire 3,10. En utilisant une lignée cellulaire dans laquelle POLQ, le gène codant pour Polθ, a été éliminé11, le test rapporteur MMEJ indépendant de la résection démontre que le MMEJ est en effet presque entièrement supprimé. L’évaluation des signaux de luminescence des composants NanoLuc et Firefly montre que le défaut de réparation observé est provoqué par une réduction du signal NanoLuc (codé par le substrat rapporteur) tandis que le signal Firefly (contrôle) n’est pas perturbé (Figure 4A-C). En revanche, l’évaluation de la compétence NHEJ à l’aide du rapporteur NHEJ à extrémité émoussée démontre que l’inactivation de POLQ n’inhibe pas la réparation du substrat rapporteur (Figure 4D-F). Ensemble, ces données génétiques soutiennent le rôle spécifique de Polθ dans la réparation médiée par MMEJ. Ces observations sont entièrement récapitulées pharmacologiquement avec ART55812,13, un inhibiteur hautement puissant et spécifique du domaine polymérase de Polθ (Figure 4G), où une inhibition titrable de MMEJ est observée, qui découle d’une diminution spécifique du signal NanoLuc et non du signal Firefly (Figure 4H). De plus, et en accord avec les données génétiques, il n’y a pas d’effet sur la NHEJ (Figure 4I,J). Ensemble, ces données mettent en évidence comment ces rapporteurs peuvent être utilisés pour caractériser la modulation génétique des voies DSBR et montrer la puissance cellulaire et la spécificité cible/voie des petites molécules. Figure 4 : Effets de l’inactivation génétique et de l’inhibition pharmacologique de Polθ sur les signaux rapporteurs MMEJ et NHEJ. Les cellules eHAP1 WT et POLQ(-) ont été transfectées avec un plasmide témoin Firefly et avec (A-C) le rapporteur MMEJ indépendant de la résection ou (D-F) rapporteur NHEJ à extrémité émoussée. Le pourcentage de réparation MMEJ ou NHEJ est le rapport entre la luminescence NanoLuc et la luminescence Firefly, normalisé par rapport au témoin traité au DMSO, 24 heures après la transfection. Les données représentent la moyenne ± MEB de trois réplicats biologiques, chacun ayant une moyenne de 8 réplicats techniques. Les cellules HEK-293 ont été transfectées avec un plasmide témoin Firefly et (G,H) le rapporteur MMEJ indépendant de la résection ou le rapporteur NHEJ à extrémité émoussée (I,J) et traitées avec l’inhibiteur de la polymérase Polθ ART558. Le pourcentage de réparation est le rapport entre la luminescence de NanoLuc et la luminescence de Firefly, normalisé par rapport au témoin traité au DMSO, 24 h après la transfection. Le pourcentage d’inhibition des signaux de luminescence individuels en (G) et (I) a été calculé par rapport au témoin traité au DMSO et montré respectivement en (H) et (J). Les données représentent ± moyenne SEM de 2 réplicats biologiques, chacun ayant une moyenne de 4 réplicats techniques. Cette figure a été adaptée de Rajendra et al.7. Abréviations : NanoLuc = Nanoluciférase ; MMEJ = jonction d’extrémité médiée par microhomologie ; NHEJ = jonction d’extrémité non homologue ; WT = type sauvage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Inhibition du signal rapporteur HR par l’inhibiteur de RAD51 CAM833. (A) Les cellules HEK-293 ont été transfectées avec le substrat rapporteur HR à matrice longue, un plasmide de contrôle de la luciférase Firefly, et traitées avec l’inhibiteur de RAD51 CAM83314. La luminescence de NanoLuc et Firefly a été lue 16 h après la transfection. Le pourcentage de réparation de la HR est le rapport entre la luminescence de NanoLuc et la luminescence de Firefly, normalisé par rapport au témoin traité au DMSO. Les lignes pointillées mettent en évidence le pourcentage d’inhibition de la FC et la concentration de CAM833 à la courbe EC50. Les données représentent ± moyenne SEM de 2 réplicats biologiques, chacun ayant une moyenne de 4 réplicats techniques. (B) Le pourcentage d’inhibition des signaux de luminescence individuels en (A) a été calculé par rapport au témoin traité au DMSO. Les lignes pointillées mettent en évidence le pourcentage d’inhibition de NanoLuc et Firefly à 3,33 μM CAM833 (EC50). La diminution du signal Firefly à des concentrations de CAM833 ≥ 10 μM est indicative d’une toxicité du composé à des doses élevées ; cependant, une réduction du signal NanoLuc est observée à des concentrations où le signal Firefly n’est pas affecté, ce qui suggère que CAM833 induit une inhibition de la HR sur la cible. Cette figure a été adaptée de Rajendra et al.7. Abréviations : NanoLuc = Nanoluciférase ; HR = recombinaison homologue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Substrat rapporteur Plasmide source(taille en Ko, résistance) Génération de DSB Taille prévue du substrat rapporteur final (kb) MMEJ indépendant de la résection 4.0, Kan Résection de 3 queues par ligature des chapeaux 1.6 MMEJ dépendant de la résection 6.5, Kan I-SceI (non cohésif), HindIII (cohésif) 6.5 NHEJ émoussé 4.3, Kan Extrémités arrondies lors de l’excision du plasmide par EcoRV 1.7 NHEJ non émoussé 6.7, Kan I-SceI (non cohésif), HindIII (cohésif) 6.5 Modèle long HR 9.2, Kan I-SceI (non cohésif), HindIII (cohésif) 9.2 Modèle court HR 9.3, ampérage I-SceI (cohésif) 9.3 SSA 9.5, Kan I-SceI (non cohésif), HindIII (cohésif) 9.5 Tableau 1 : Plasmides de substrat rapporteur. Abréviations : DSB = rupture de brin double ; MMEJ = jonction d’extrémité médiée par microhomologie ; NHEJ = jonction d’extrémité non homologue ; HR = recombinaison homologue ; SSA = recuit monobrin ; Kan = kanamycine ; Amp = ampicilline. Séquence (5′-3′) Fournisseur Purification Fonction 5′[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTTGTAGCCGGCTGTCTGTCGCCAGTCCCCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACTAC Sigma PAGE Capuchon gauche, oligonucléotide long 5′[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC Sigma PAGE Capuchon gauche, oligonucléotide court 5′[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGGGCCTCGGCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG Sigma PAGE Capuchon droit, oligonucléotide long 5′[Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA Sigma PAGE Capuchon droit, oligonucléotide court Tableau 2 : Oligonucléotides pour les coiffes pour la génération d’un substrat rapporteur MMEJ indépendant de la résection. Abréviations : ADNsb = ADN simple brin ; ADNdb = ADN double brin ; MMEJ = jonction d’extrémité médiée par microhomologie ; PAGE = électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les microhomologies sont soulignées. Test du rapporteur ADN du substrat rapporteur NanoLuc (μg d’ADN/1×106 cellules) Plasmide luciférase de contrôle des luciférases (μg d’ADN/1×106 cellules) MMEJ indépendant de la résection 0.5 0.66 MMEJ dépendant de la résection 1 0.66 NHEJ émoussé 0.5 0.66 NHEJ non émoussé 0.5 0.66 Modèle long HR 1 0.66 Modèle court HR 2 0.66 SSA 1 0.66 Tableau 3 : Quantités d’ADN pour la transfection transitoire des substrats rapporteurs de NanoLuc et du plasmide luciférase de contrôle Firefly (HEK-293, format de plaque à 96 puits). Abréviations : MMEJ = jonction d’extrémité médiée par la microhomologie ; NHEJ = jonction d’extrémité non homologue ; HR = recombinaison homologue ; SSA = recuit monobrin.

Discussion

Ici, nous avons décrit des protocoles pour la génération et la mise en œuvre d’une suite de rapporteurs basés sur la luminescence extrachromosomique pour mesurer la compétence cellulaire des quatre principales voies DSBR (HR, NHEJ, MMEJ et SSA)7. Les substrats rapporteurs peuvent être introduits dans les cellules par transfection transitoire et utilisés pour évaluer l’activité DSBR à l’aide d’une lecture sensible et robuste de la luminescence NanoLuc, qui est reconstituée lors de l’engagement avec les voies cellulaires DSBR apparentées.

Plusieurs étapes de la génération du substrat rapporteur, de la transfection des substrats en cellules et de l’interprétation des données sont essentielles à la réussite de l’exécution de ces tests. Bien que des techniques standard de biologie moléculaire soient utilisées pour générer les substrats rapporteurs, la visualisation du processus par électrophorèse sur gel garantit la plus haute qualité et pureté des substrats avant la transfection. Comme ces tests reposent sur la transfection transitoire, des considérations courantes s’appliquent à ces méthodes. Il s’agit notamment d’optimiser la densité d’ensemencement, les conditions de transfection (y compris les réactifs et les quantités d’ADN) et d’évaluer l’adéquation dans les formats de transfection directe et inverse. Ces tests rapporteurs ont été réalisés avec succès avec une gamme de protocoles d’électroporation et de lipofection, et les options doivent être pleinement explorées avant d’effectuer ces tests. Il faut également prendre soin d’inspecter les signaux NanoLuc et Firefly plutôt que simplement le signal de réparation composite dérivé de la normalisation du signal NanoLuc (substrat rapporteur) en signal Firefly (contrôle). Des artefacts peuvent provenir du rapport déterminé par des changements dans le signal Firefly. Par exemple, l’évaluation de l’inhibition en mode dose-réponse à l’aide d’un composé hautement spécifique devrait supprimer le signal NanoLuc de manière titulable sans perturber le signal Firefly, qui devrait rester stable (Figure 4G,H). Cependant, dans les cas où les signaux Firefly sont perturbés, les impacts utiles sur la réparation peuvent encore être déterminés en identifiant une fenêtre de dose où le signal Firefly n’est pas affecté (Figure 5).

Par rapport aux tests de rapporteur DSBR les plus fréquemment utilisés, ces tests de rapporteur basés sur la luminescence extrachromosomique présentent des avantages distincts. Comme les voies DSBR sont hautement conservées, même si la machinerie cellulaire varie entre les modèles cellulaires, les tests peuvent toujours rendre compte de la compétence DSBR et du choix de la voie. Cela ouvre l’évaluation du DSBR à tout modèle d’intérêt pour l’utilisateur, à condition que les conditions optimales de transfection transitoire soient établies à l’avance.

L’utilisation de la nanoluciférase comme gène rapporteur offre également des avantages par rapport aux options fluorescentes, qui ont été traditionnellement utilisées dans les tests rapporteurs DSBR. NanoLuc est à maturation rapide et la luminescence est détectée avec une grande sensibilité à l’aide d’un lecteur de plaques8. Associé à la rapidité de réparation du substrat (car les substrats rapporteurs sont transfectés dans des cellules avec des extrémités DSB prêtes à être réparées), ce format de test rapporteur DSBR est idéal pour le délai d’exécution rapide et la robustesse quantitative requis pour le criblage de petites molécules dans le cadre d’une cascade de découverte de médicaments industriels. En effet, nous avons récemment décrit la mise en œuvre du test rapporteur MMEJ indépendant de la résection dans la cascade de découverte utilisée pour l’identification de petites molécules inhibitrices du domainepolymérase Polθ 13.

Il existe également une certaine souplesse dans la mise en œuvre des tests rapporteurs pour répondre à des questions spécifiques sur les perturbations génétiques et pharmacologiques du DSBR (Figure 3). Par exemple, avant la transfection des substrats rapporteurs, les cellules peuvent être transfectées avec siRNA contre un gène d’intérêt pendant 48 à 72 h. Alternativement, les effets de la surexpression des gènes sur les voies DSBR peuvent être testés en effectuant la transfection plasmidique 24-48 h avant la transfection des substrats rapporteurs. Pour les études pharmacologiques, le protocole actuel décrit déjà comment l’utilisation de petites molécules peut être intégrée dans le flux de travail standard, mais d’autres formats peuvent inclure des modifications dans les régimes de traitement des composés, tels que les pré-incubations ou les lavages.

L’évolutivité de la transfection transitoire pourrait également soutenir des approches de criblage à grande échelle dans lesquelles la transfection par lots des substrats rapporteurs est effectuée avant le dépistage. De plus, la durée du dosage, de la transfection à la lecture, peut également varier. Bien que les durées standard puissent être de 16 à 24 h, certains tests peuvent être lus en aussi peu que 6 h7. Les préoccupations concernant la toxicité de petites molécules ou d’ARNi qui peuvent compromettre la viabilité cellulaire doivent également être prises en compte dans la détermination de la durée de l’essai.

En résumé, les tests décrits dans cette étude et décrits en détail dans une publication récente7 fournissent une évaluation rapide et robuste de la compétence cellulaire DSBR. Ils sont très sensibles et titrables, ce qui les rend susceptibles d’études génétiques et pharmacologiques. De manière cruciale, comme les substrats rapporteurs peuvent être introduits dans les cellules par transfection transitoire, ils ont le potentiel d’être utilisés dans n’importe quel modèle de cellule transfectable d’intérêt, plutôt que d’être limités à des lignées cellulaires spécifiques par une intégration stable comme c’est le cas avec les rapporteurs DSBR chromosomiques. Cependant, une limitation distincte de ces tests extrachromosomiques rapporteurs est que le manque d’intégration dans le génome peut ne pas récapituler complètement le contexte physiologique et chromatinisé de la réparation de l’ADN et ses signaux régulateurs et orchestration associés15. À cette fin, les tests de rapporteurs extrachromosomiques sont complémentaires aux méthodes existantes d’évaluation du DSBR et élargissent la boîte à outils de ressources adaptées à la fois à la recherche fondamentale et à la découverte de médicaments.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Tous les travaux ont été financés par Artios Pharma Ltd. Les figures 1 et 3 ont été créées avec Biorender.com.

Materials

10x TBE buffer Thermo Fisher AM9863
20% TBE-acrylamide gel Invitrogen EC6315BOX
50x TAE buffer Fisher Scientific BP13321
6x Gel Loading Dye, Purple NEB B7024S
96-well white plate (with transparent bottom and lid) Porvair 204012
Agarose Cleaver Scientific CSL-AG500
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 For bead-based purification of DNA
Antarctic phosphatase and 10X buffer NEB M0289L
CLARIOstar BMG Labtech 430-101 Plate reader
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher AMQAX1000 Cell counter
Custom oligonucleotides Sigma-Aldrich Custom order For resection-independent MMEJ substrate. See Table 2.
D300e Tecan 30100152 DMSO-based compound dispenser
D300e D4+ cassette Tecan 30097371 High volume cassette for D300e compound dispenser
D300e T8+ cassette Tecan 30097370 Low volume cassette for D300e compound dispenser
Dimethyl sulfoxide, cell culture grade Sigma-Aldrich D2650-100ML Vehicle for compounds, used in Figure 4 and Figure 5
DSBR reporter source plasmids Artios Available to the academic community upon request 
EcoRV-HF and 10x CutSmart buffer NEB R3195M
Ethanol absolute VWR 20821.365
Foetal Bovine Serum PAN-Biotech P30-3031 
GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder Thermo Fisher SM1211 Low molecular weight DNA ladder
HEK-293 cells ATCC CRL-1573 Example cell line used in protocol
HindIII-HF and 10x CutSmart buffer NEB R3104M
HyClone Molecular Biology grade water Fisher Scientific 10275262
I-SceI and 10x Tango Buffer Invitrogen ER1771
Isopropanol VWR 20842.33
JetPRIME reagent and buffer PolyPlus 114-15 Lipid-based transfection reagent
MegaStar 1.6 VWR 521-1749 Centrifuge for 15 or 50 mL tubes
MEM Eagle PAN-Biotech P04-08056 Culture medium for HEK-293 cells
Microplate shaker Fisherbrand 15504070 Microplate orbital shaker
MicroStar 17R VWR 521-1647 Centrifuge for 1.5 or 2 mL tubes
MultiDrop Thermo Fisher 5840300 Cell or water-based reagent dispenser
MultiDrop Standard Cassette Thermo Fisher 24072670 Cassette for MultiDrop reagent dispenser
NanoDLR Stop & Glo Buffer and Substrate Promega N1630 or N1650 Reporter luciferase (NanoLuc) reagent to quench Firefly luminescence and detect NanoLuc luminescence. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit
ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate Promega N1630 or N1650 Control luciferase (Firefly) assay reagent to detect Firefly. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit
PBS (without calcium or magnesium) PAN-Biotech P04-36500
pGL4 Firefly plasmid (or similar) Promega E1310 (or equivalent) Firefly control plasmid
pNL1.1 NanoLuc plasmid (or similar) Promega N1091 (or equivalent) NanoLuc control plasmid, for adjustment of equipment settings/optimisation experiments
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28706
Quick-Load Purple 1 kb DNA Ladder NEB N0552S High molecular weight DNA ladder
Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 Thermo Fisher AM9740 For pH adjustment during gel extraction with QIAquick Gel Extraction Kit
SYBR Gold (10,000x) Invitrogen S11494 For visualisation of ssDNA and dsDNA
SYBR Safe (10,000x) Invitrogen S33102 For visualisation of dsDNA only
T4 DNA Ligase and 10x Ligase buffer NEB M0202L
Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen T10282 For measurement of viability during cell counting
Trypsin-EDTA solution; 0.25% Trypsin and 0.53 mM EDTA Sigma-Aldrich T4049-100ML
XhoI and 10x CutSmart buffer NEB R0146M
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Referencias

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Grande, D., Rajendra, E., Mason, B., Galbiati, A., Boulton, S. J., Smith, G. C. M., Robinson, H. M. R. Assessment of DNA Double Strand Break Repair Activity Using High-throughput and Quantitative Luminescence-Based Reporter Assays. J. Vis. Exp. (208), e66969, doi:10.3791/66969 (2024).
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