Оценка активности репарации двухцепочечного разрыва ДНК с использованием высокопроизводительных и количественных репортерных анализов на основе люминесценции
Summary
Мы представляем протоколы для оценки эффективности пути репарации двухцепочечного разрыва в клетках с использованием набора экстрахромосомных репортерных субстратов на основе люминесценции.
Abstract
Репарация двухцепочечных разрывов ДНК (DSB) имеет решающее значение для поддержания стабильности генома и жизнеспособности клеток. Репарация DSB (DSBR) в клетках опосредована несколькими механизмами: гомологичной рекомбинацией (HR), негомологичным соединением концов (NHEJ), микрогомологически опосредованным соединением концов (MMEJ) и одноцепочечным отжигом (SSA). Клеточные анализы необходимы для измерения эффективности и модуляции этих путей в ответ на различные стимулы.
Здесь мы представляем набор внехромосомных репортерных анализов, каждый из которых измеряет восстановление репортерного гена нанолюциферазы одним из четырех основных путей DSBR в клетках. После транзиторной трансфекции в клетки, представляющие интерес, репарация чувствительных к путям репортерных субстратов может быть измерена менее чем за 24 ч путем детектирования люминесценции нанолюциферазы (NanoLuc).
Эти надежные анализы являются количественными, чувствительными, титруемыми и поддаются высокопроизводительному формату скрининга. Эти свойства обеспечивают широкое применение в исследованиях репарации ДНК и открытии лекарств, дополняя доступный в настоящее время набор инструментов клеточного анализа DSBR.
Introduction
Двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) представляют собой особенно токсичный класс повреждений ДНК1, из-за которых клетки развили множественные пути репарации DSB (DSBR) для восстановления этих повреждений. Четырьмя основными механизмами DSBR являются гомологичная рекомбинация (HR), негомологичное соединение концов (NHEJ), микрогомологически опосредованное соединение концов (MMEJ) и одноцепочечный отжиг (SSA)2,3. Пути DSBR способствуют поддержанию здорового развития тканей и физиологии и защищают от таких заболеваний, как рак. Кроме того, эти механизмы репарации обладают терапевтическим потенциалом для разработки низкомолекулярных модуляторов в прецизионной онкологии. Например, нацеливание на ДНК-полимеразу θ (Polθ), ключевой фермент в пути репарации MMEJ, привлекло интерес из-за ее синтетической летальности при дефиците HR при раке4.
Таким образом, понимание DSBR имеет широкое клиническое применение, и необходимы функциональные клеточные анализы, способные измерять активность всех основных путей DSBR5. Анализы должны быть пригодны как для генетических, так и для фармакологических исследований и использоваться на представляющих интерес клеточных моделях. Чтобы поддержать усилия по разработке низкомолекулярных лекарств, анализы должны быть высокочувствительными, титруемыми, иметь быстрый оборот и быть масштабируемыми до высокопроизводительных форматов, подходящих для скрининга соединений.
В целом, DSBR ранее измерялся с использованием репортерных аналитических систем на основе флуоресценции, стабильно интегрированных вгеном клетки6. Тем не менее, в то время как физиологическая рекапитуляция хромосомного DSBR является явным преимуществом, такие анализы ограничены моделью хозяина, в которую интегрирован репортер, используют трудоемкую подготовку образцов и анализ с помощью проточной цитометрии, а также имеют ограниченную пропускную способность, время выполнения, надежность и чувствительность — все это важные характеристики, необходимые для разработки лекарств.
Здесь мы описываем набор репортерных анализов DSBR, которые позволяют оценить четыре основных пути DSBR. Набор субстратов для репортерного анализа представлен на рисунке 1 и более подробно описан в недавней публикации7. Они являются внехромосомными, что позволяет им внедряться в клетки путем простой транзиторной трансфекции, а включение репортерного гена8 нанолюциферазы, который должен быть восстановлен путем взаимодействия со специфическими механизмами DSBR, порождает чувствительность, надежность и масштабируемость. В протокол включены следующие варианты субстрата репортера DSBR (рисунок 1):
Резекционно-независимый MMEJ: Этот линейный субстрат состоит из основного участка двухцепочечной ДНК (дцДНК) с выступами одноцепочечной ДНК (одноцепочечной ДНК), которые имитируют резецированные концы ДНК9. Четыре нуклеотидные микрогомологии на концах областей одноцепочечной ДНК кодируют стартовый кодон для репортерного гена. Репарация этого субстрата с помощью MMEJ восстанавливает открытую рамку считывания репортерного гена (ORF).
Резекционно-зависимый MMEJ: N-концевой экзон репортерного гена прерывается сегментом, содержащим стоп-кодон, который фланкирован 8 микрогомологиями пар оснований (.о.). Нуклеолитическая резекция конца требуется перед MMEJ-опосредованной репарацией для восстановления интактного репортерного гена.
Блант Нхей: Репортерный ген расщепляется на N- и C-концевые участки, последний из которых размещается выше промотора. DSB производится с использованием EcoRV и требует прямого лигирования (без обработки конца) NHEJ для повторного соединения обеих частей репортерного гена и восстановления репортерного ORF.
Нетупой NHEJ: DSB расположен внутри интрона и будет иметь связующие или несвязные концы в зависимости от выбора фермента рестрикции. Ремонт этого субстрата NHEJ требует лигирования, которому предшествует конечная обработка.
Длинный шаблон HR: N-концевой экзон репортерного гена прерывается сегментом ДНК, содержащим сайты рестрикции, которые заменяют 22.о. исходной последовательности репортерного гена. Для восстановления этой последовательности при репарации с помощью HR используется гомологический шаблон размером 2,5 килооснования (кб), помещенный ниже по потоку от С-концевого экзона.
Короткий шаблон HR: Сайт рестрикции, необходимый для генерации DSB, заменяет часть нативной последовательности репортерного гена и вводит стоп-кодон в кадре. Как и версия с длинным шаблоном, эта HR-подложка требует нисходящего шаблона гомологии (360.н.) для точного ремонта и восстановления ORF репортера.
SSA: Этот субстрат содержит преждевременный стоп-кодон, расположенный в N-концевом экзоне репортерного гена. Удаление этого стоп-кодона и восстановление интактной последовательности репортерного гена требует репарации с помощью SSA, которая включает в себя двунаправленную дальнюю резекцию перед выравниванием гомологий.
Для получения DSB некоторые из репортерных субстратов могут быть расщеплены с помощью I-SceI (рис. 1). Это позволит получить линейную подложку с несвязными концами в резекционно-зависимых MMEJ, нетупых NHEJ, длинных шаблонах HR и SSA, которые имеют тандемные сайты I-SceI в инвертированных ориентациях. В коротком шаблоне подложки HR-репортера усвоение одного сайта I-SceI приведет к созданию связных концов. Нетупые NHEJ, резекционно-зависимые MMEJ, длинные матрицы HR и SSA плазмиды также могут быть расщеплены с помощью HindIII, что приведет к получению комплементарных когезивных концов.
Мы предоставляем протоколы для создания субстратов репортерного анализа и описываем, как эти анализы могут быть выполнены, предоставляя подробную информацию о том, как они могут быть использованы для количественной оценки DSBR, включая титруемые ответы на малые молекулы, оценку клеточной активности, целевой активности и селективности путей.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной работе мы описали протоколы для создания и реализации набора репортеров на основе экстрахромосомной люминесценции для измерения клеточного мастерства четырех основных путей DSBR (HR, NHEJ, MMEJ и SSA)7. Репортерные субстраты могут быть введены в клетки путем транзиторной трансфекции и использованы для оценки активности DSBR с использованием чувствительного и надежного считывания люминесценции NanoLuc на основе пластин, которое восстанавливается при взаимодействии с родственными клеточными путями DSBR.
Несколько этапов генерации репортерного субстрата, трансфекции субстратов в клетки и интерпретации данных имеют решающее значение для успешного проведения этих анализов. Несмотря на то, что для создания репортерных субстратов используются стандартные методы молекулярной биологии, визуализация процесса с помощью гель-электрофореза обеспечивает высочайшее качество и чистоту субстратов до трансфекции. Поскольку эти анализы основаны на транзиторной трансфекции, применяются общие соображения для этих методов. К ним относятся оптимизация плотности посева, условий трансфекции (включая реагенты и количество ДНК), а также оценка пригодности в форматах прямой и обратной трансфекции. Эти репортерные анализы были успешно проведены с использованием ряда протоколов электропорации и липофектии, и перед проведением этих анализов следует полностью изучить возможные варианты. Следует также позаботиться о проверке компонентных сигналов NanoLuc и Firefly, а не только композитного сигнала восстановления, полученного путем нормализации сигнала NanoLuc (репортерная подложка) к сигналу Firefly (контроль). Артефакты могут возникать из-за того, что соотношение обусловлено изменениями в сигнале Firefly. Например, оценка ингибирования в режиме «доза-реакция» с использованием высокоспецифичного соединения должна подавлять сигнал NanoLuc титруемым образом, не нарушая сигнал Firefly, который должен оставаться стабильным (рис. 4G, H). Тем не менее, в тех случаях, когда сигналы Firefly возмущены, полезное влияние на репарацию все еще может быть определено путем определения окна дозы, в котором сигнал Firefly не подвержен влиянию (рис. 5).
По сравнению с наиболее часто используемыми репортерными анализами DSBR, эти репортерные анализы на основе внехромосомной люминесценции имеют некоторые явные преимущества. Поскольку пути DSBR высоко консервативны, даже если клеточный механизм различается в зависимости от модели клеток, анализы все равно могут сообщать об уровне владения DSBR и выборе пути. Это открывает возможность оценки DSBR для любой модели, представляющей интерес для пользователя, при условии, что оптимальные условия трансфекции переходных процессов будут установлены заранее.
Использование нанолюциферазы в качестве репортерного гена также имеет преимущества по сравнению с флуоресцентными вариантами, которые традиционно использовались в репортерных анализах DSBR. NanoLuc быстро созревает, а люминесценция обнаруживается с высокой чувствительностью с помощью планшетного ридера8. В сочетании со скоростью восстановления субстрата (поскольку репортерные субстраты трансфицируются в клетки с готовыми к восстановлению концами DSB), этот формат репортерного анализа DSBR идеально подходит для быстрого выполнения и количественной надежности, необходимых для скрининга малых молекул в рамках каскада промышленных разработок лекарств. Действительно, недавно мы описали реализацию независимого от резекции репортерного анализа MMEJ в каскаде открытий, используемом для идентификации низкомолекулярных ингибиторов полимеразного домена Polθ13.
Кроме того, существует гибкость в проведении репортерных анализов для решения конкретных вопросов о генетических и фармакологических нарушениях DSBR (Рисунок 3). Например, перед трансфекцией репортерных субстратов клетки могут быть трансфицированы миРНК против гена, представляющего интерес, в течение 48-72 ч. В качестве альтернативы, влияние сверхэкспрессии генов на пути DSBR можно проверить, выполнив трансфекцию плазмид за 24-48 ч до трансфекции репортерных субстратов. Что касается фармакологических исследований, то в настоящем протоколе уже описано, как использование малых молекул может быть включено в стандартный рабочий процесс, но альтернативные форматы могут включать изменения в режимах обработки соединениями, такие как предварительная инкубация или промывка.
Масштабируемость транзиторной трансфекции может также поддерживать широкомасштабные подходы к скринингу, при которых периодическая трансфекция репортерных субстратов выполняется до скрининга. Кроме того, продолжительность анализа от трансфекции до считывания также может варьироваться. Хотя стандартная продолжительность может составлять 16-24 часа, некоторые анализы могут быть прочитаны всего за 6 часов7 часов. Опасения по поводу токсичности малых молекул или миРНК, которые могут поставить под угрозу жизнеспособность клеток, также должны учитываться при определении продолжительности анализа.
Таким образом, анализы, изложенные в этом исследовании и полностью описанные в недавней публикации7 , обеспечивают быструю и надежную оценку квалификации клеточного DSBR. Они обладают высокой чувствительностью и титруемостью, что делает их пригодными как для генетических, так и для фармакологических исследований. Важно отметить, что, поскольку репортерные субстраты могут быть введены в клетки путем транзиторной трансфекции, они имеют потенциал для использования в любой интересующей нас модели трансфицируемой клетки, а не ограничиваются конкретными клеточными линиями путем стабильной интеграции, как в случае с хромосомными репортерами DSBR. Тем не менее, явным ограничением этих репортерных экстрахромосомных анализов является то, что отсутствие интеграции в геном может не полностью повторять физиологический, хроматинизированный контекст репарации ДНК и связанные с ним регуляторные сигналыи оркестровку. С этой целью внехромосомные репортерные анализы дополняют существующие методы оценки DSBR и расширяют инструментарий ресурсов, пригодных как для фундаментальных исследований, так и для разработки лекарств.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Все работы финансировались компанией Artios Pharma Ltd. Рисунок 1 и Рисунок 3 были созданы совместно с Biorender.com.
Materials
| 10x TBE buffer | Thermo Fisher | AM9863 | |
| 20% TBE-acrylamide gel | Invitrogen | EC6315BOX | |
| 50x TAE buffer | Fisher Scientific | BP13321 | |
| 6x Gel Loading Dye, Purple | NEB | B7024S | |
| 96-well white plate (with transparent bottom and lid) | Porvair | 204012 | |
| Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | For bead-based purification of DNA |
| Antarctic phosphatase and 10X buffer | NEB | M0289L | |
| CLARIOstar | BMG Labtech | 430-101 | Plate reader |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Cell counter |
| Custom oligonucleotides | Sigma-Aldrich | Custom order | For resection-independent MMEJ substrate. See Table 2. |
| D300e | Tecan | 30100152 | DMSO-based compound dispenser |
| D300e D4+ cassette | Tecan | 30097371 | High volume cassette for D300e compound dispenser |
| D300e T8+ cassette | Tecan | 30097370 | Low volume cassette for D300e compound dispenser |
| Dimethyl sulfoxide, cell culture grade | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehicle for compounds, used in Figure 4 and Figure 5 |
| DSBR reporter source plasmids | Artios | Available to the academic community upon request | |
| EcoRV-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3195M | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.365 | |
| Foetal Bovine Serum | PAN-Biotech | P30-3031 | |
| GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder | Thermo Fisher | SM1211 | Low molecular weight DNA ladder |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | Example cell line used in protocol |
| HindIII-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3104M | |
| HyClone Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | 10275262 | |
| I-SceI and 10x Tango Buffer | Invitrogen | ER1771 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.33 | |
| JetPRIME reagent and buffer | PolyPlus | 114-15 | Lipid-based transfection reagent |
| MegaStar 1.6 | VWR | 521-1749 | Centrifuge for 15 or 50 mL tubes |
| MEM Eagle | PAN-Biotech | P04-08056 | Culture medium for HEK-293 cells |
| Microplate shaker | Fisherbrand | 15504070 | Microplate orbital shaker |
| MicroStar 17R | VWR | 521-1647 | Centrifuge for 1.5 or 2 mL tubes |
| MultiDrop | Thermo Fisher | 5840300 | Cell or water-based reagent dispenser |
| MultiDrop Standard Cassette | Thermo Fisher | 24072670 | Cassette for MultiDrop reagent dispenser |
| NanoDLR Stop & Glo Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Reporter luciferase (NanoLuc) reagent to quench Firefly luminescence and detect NanoLuc luminescence. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
| ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Control luciferase (Firefly) assay reagent to detect Firefly. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
| PBS (without calcium or magnesium) | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| pGL4 Firefly plasmid (or similar) | Promega | E1310 (or equivalent) | Firefly control plasmid |
| pNL1.1 NanoLuc plasmid (or similar) | Promega | N1091 (or equivalent) | NanoLuc control plasmid, for adjustment of equipment settings/optimisation experiments |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| Quick-Load Purple 1 kb DNA Ladder | NEB | N0552S | High molecular weight DNA ladder |
| Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 | Thermo Fisher | AM9740 | For pH adjustment during gel extraction with QIAquick Gel Extraction Kit |
| SYBR Gold (10,000x) | Invitrogen | S11494 | For visualisation of ssDNA and dsDNA |
| SYBR Safe (10,000x) | Invitrogen | S33102 | For visualisation of dsDNA only |
| T4 DNA Ligase and 10x Ligase buffer | NEB | M0202L | |
| Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | For measurement of viability during cell counting |
| Trypsin-EDTA solution; 0.25% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| XhoI and 10x CutSmart buffer | NEB | R0146M |
Referencias
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).
- Ramsden, D. A., Carvajal-Garcia, J., Gupta, G. P. Mechanism, cellular functions and cancer roles of polymerase-theta-mediated DNA end joining. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 125-140 (2022).
- Ceccaldi, R., et al. Homologous-recombination-deficient tumours are dependent on Polθ-mediated repair. Nature. 518 (7538), 258-262 (2015).
- van de Kooij, B., van Attikum, H. Genomic reporter constructs to monitor pathway-specific repair of DNA double-strand breaks. Front Genet. 12, 809832 (2021).
- Gunn, A., Stark, J. M. I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks. Methods Mol Biol. 920 (9), 379-391 (2012).
- Rajendra, E., et al. titratable and high-throughput reporter assays to measure DNA double strand break repair activity in cells. Nucleic Acids Res. 52 (4), 1736-1752 (2024).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- Wyatt, D. W., et al. Essential roles for polymerase θ-mediated end joining in the repair of chromosome breaks. Mol Cell. 63 (4), 662-673 (2016).
- Wood, R. D., Doublié, S. Genome protection by DNA polymerase θ. Annu Rev Genet. 56, 207-228 (2022).
- Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Mol Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).
- Zatreanu, D., et al. Polθ inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance. Nat Commun. 12 (1), 3636 (2021).
- Stockley, M. L., et al. Discovery, characterization, and structure-based optimization of small-molecule in vitro and in vivo probes for human DNA polymerase theta. J Med Chem. 65 (20), 13879-13891 (2022).
- Scott, D. E., et al. A small-molecule inhibitor of the BRCA2-RAD51 interaction modulates RAD51 assembly and potentiates DNA damage-induced cell death. Cell Chem Biol. 28 (6), 835-847 (2021).
- Schep, R., et al. Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance. Mol Cell. 81 (10), 2216-2230 (2021).
