고처리량 및 정량적 발광 기반 리포터 분석을 사용한 DNA 이중 가닥 파손 복구 활성 평가
Summary
우리는 발광 기반 염색체 외 리포터 기질 세트를 사용하여 세포에서 이중 가닥 절단 복구 경로 숙련도를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
DNA 이중 가닥 절단(DSB)의 복구는 게놈 안정성과 세포 생존율의 유지에 매우 중요합니다. 세포의 DSB 복구(DSBR)는 상동 재조합(HR), 비상동 말단 결합(NHEJ), 미세 호몰로지 매개 말단 결합(MMEJ) 및 단일 가닥 어닐링(SSA)과 같은 여러 메커니즘을 통해 매개됩니다. 세포 분석은 다양한 자극에 대한 반응으로 이러한 경로의 숙련도와 조절을 측정하는 데 필수적입니다.
여기에서는 세포의 4가지 주요 DSBR 경로 중 하나에 의한 나노루시페라아제 리포터 유전자의 재구성을 각각 측정하는 염색체 외 리포터 분석 제품군을 제시합니다. 관심 세포로의 일시적인 transfection시 Nanoluciferase (NanoLuc) 발광의 검출을 통해 경로 특이적 리포터 기질의 복구를 24시간 이내에 측정할 수 있습니다.
이러한 강력한 분석은 정량적이고, 민감하며, 적정이 가능하고, 고처리량 스크리닝 형식으로 조정할 수 있습니다. 이러한 특성은 DNA 복구 연구 및 약물 발견에 광범위한 응용 분야를 제공하며 현재 사용 가능한 세포 DSBR 분석 툴킷을 보완합니다.
Introduction
DNA 이중 가닥 절단(DSB)은 특히 독성이 강한DNA 손상1을 나타내며, 이로 인해 세포는 이러한 병변을 복구하기 위해 다중 DSB 복구(DSBR) 경로를 진화시켰습니다. 4가지 주요 DSBR 메커니즘은 상동 재조합(HR), 비상동 말단 결합(NHEJ), 미세 호몰로지 매개 말단 결합(MMEJ) 및 단일 가닥 어닐링(SSA)2,3입니다. DSBR 경로는 건강한 조직 발달 및 생리학적 유지에 기여하고 암과 같은 질병으로부터 보호합니다. 또한, 이러한 복구 메커니즘은 정밀 종양학에서 소분자 조절제의 개발을 위한 치료 잠재력을 가지고 있습니다. 예를 들어, MMEJ 복구 경로의 중추적 효소인 DNA Polymerase θ (Polθ)를 표적으로 하는 것은 암에서 HR 결핍에 대한 합성 치사율로 인해 관심을 끌었습니다4.
따라서 DSBR에 대한 이해는 광범위한 임상적 의미를 가지며 모든 주요 DSBR 경로의 활성을 측정할 수 있는 기능적 세포 분석이 필요하다5. 분석은 유전 및 약리학적 조사에 모두 적합해야 하며 관심 세포 모델 전반에 걸쳐 배포할 수 있어야 합니다. 저분자 약물 발견 노력을 지원하기 위해 분석은 감도가 높고, 적정 가능하고, 처리 시간이 빠르고, 화합물 스크리닝에 적합한 고처리량 형식으로 확장 가능해야 합니다.
일반적으로 DSBR은 이전에 세포 게놈에 안정적으로 통합된 형광 기반 리포터 분석 시스템을 사용하여 측정되었습니다6. 그러나 염색체 DSBR의 생리학적 재현은 뚜렷한 장점이지만, 이러한 분석은 리포터가 통합된 호스트 모델로 제한되고, 유세포 분석을 통한 노동 집약적인 시료 준비 및 분석을 활용하며, 약물 발견 노력에 필요한 모든 필수 기능인 처리량, 처리 시간, 견고성 및 감도가 제한됩니다.
여기에서는 4가지 주요 DSBR 경로를 평가할 수 있는 DSBR 리포터 분석 제품군에 대해 설명합니다. 리포터 분석 기판 제품군은 그림 1 에 요약되어 있으며 최근 간행물7에 자세히 설명되어 있습니다. 이들은 염색체 외(extrachromosom)로, 간단한 일시적인 transfection에 의해 세포에 도입될 수 있으며, 특정 DSBR 메커니즘과의 결합에 의해 재구성되어야 하는 나노루시페라아제 리포터 유전자8의 통합은 민감성, 견고성 및 확장성을 제공합니다. 프로토콜에는 다음과 같은 DSBR 리포터 기판 변형이 포함되어 있습니다(그림 1).
절제 독립적 MMEJ: 이 선형 기질은 절제된 DNA 말단을 모방한 단일 가닥 DNA(ssDNA) 돌출부가 있는 코어 이중 가닥 DNA(dsDNA) 영역으로 구성됩니다9. ssDNA 영역의 말단에 있는 4개의 뉴클레오티드 마이크로호몰로지(microhomologies)는 리포터 유전자의 시작 코돈(start codon)을 암호화합니다. MMEJ를 통해 이 기질을 복구하면 리포터 유전자 ORF(Open Reading Frame)가 복원됩니다.
절제 의존성 MMEJ: N-말단 리포터 유전자 엑손은 정지 코돈(stop codon)을 포함하는 분절에 의해 중단되며, 이 분절은 8개의 염기쌍(bp) 미세호모로지(microhomologies)로 둘러싸여 있습니다. 온전한 리포터 유전자를 복원하기 위해 MMEJ 매개 복구 전에 핵분해 말단 절제가 필요합니다.
무뚝뚝한 NHEJ: 리포터 유전자는 N- 말단 및 C-말단 부분으로 나뉘며, 그 중 C-말단 섹션은 프로모터의 상류에 배치됩니다. DSB는 EcoRV를 사용하여 생산되며, 리포터 유전자 부분을 재결합하고 리포터 ORF를 복원하기 위해 NHEJ에 의한 직접 결찰(말단 처리 없이)이 필요합니다.
무딘 NHEJ: DSB는 인트론 내에 위치하며 제한 효소의 선택에 따라 응집성 또는 비응집성 끝을 갖습니다. NHEJ에 의한 이 기질의 수리는 말단 처리가 선행되어야 합니다.
긴 템플릿 HR: 리포터 유전자의 N-말단 엑손은 원래 리포터 유전자 염기서열의 22bp를 대체하는 제한 부위를 포함하는 DNA 세그먼트에 의해 중단됩니다. 이 염기서열을 복원하기 위해 HR의 수리는 C-말단 엑손의 다운스트림에 배치된 2.5킬로베이스(kb) 상동성 템플릿을 사용합니다.
짧은 템플릿 HR: DSB를 생성하는 데 필요한 제한 부위는 네이티브 리포터 유전자 염기서열의 일부를 대체하고 프레임 내 정지 코돈을 도입합니다. 긴 템플릿 버전과 마찬가지로 이 HR 기판은 리포터 ORF의 정확한 수리 및 복원을 위해 다운스트림 상동성 템플릿(360bp)이 필요합니다.
특수: 이 기질은 리포터 유전자의 N-말단 엑손(exon) 내에 위치한 조기 정지 코돈(premature stop codon)을 함유하고 있습니다. 이 정지 코돈을 제거하고 온전한 리포터 유전자 염기서열을 복원하려면 SSA에 의한 복구가 필요하며, 여기에는 상동성의 정렬 전에 양방향 장거리 절제가 포함됩니다.
DSB 생성을 위해 일부 리포터 기판은 I-SceI로 분해할 수 있습니다(그림 1). 이렇게 하면 반전 방향의 탠덤 I-SceI 사이트가 있는 절제 의존성 MMEJ, 비평활 NHEJ, 긴 템플릿 HR 및 SSA 리포터에서 응집력이 없는 끝을 가진 선형 기판이 생성됩니다. 짧은 템플릿 HR 리포터 기판에서 단일 I-SceI 사이트의 소화는 응집력 있는 끝을 생성합니다. non-blunt NHEJ, resection-dependent MMEJ, long template HR 및 SSA plasmid는 HindIII로 절단할 수 있으며, 이는 상호보완적인 응집력 말단을 생성합니다.
당사는 리포터 분석 기질의 생성을 위한 프로토콜을 제공하고 분석을 수행할 수 있는 방법을 설명하며, 소분자에 대한 적정 반응, 세포 효능, 표적 활성 및 경로 선택성 평가를 포함하여 DSBR을 정량화하는 데 사용할 수 있는 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 4가지 주요 DSBR 경로(HR, NHEJ, MMEJ 및 SSA)7의 세포 숙련도를 측정하기 위한 염색체 외 발광 기반 리포터 제품군의 생성 및 구현을 위한 프로토콜에 대해 설명했습니다. 리포터 기질은 일시적인 transfection에 의해 세포에 도입될 수 있으며, 동족 세포 DSBR 경로와의 결합에 따라 재구성되는 NanoLuc 발광의 민감하고 견고한 플레이트 기반 판독을 사용하여 DSBR 활성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
리포터 기판 생성, 기판을 세포로 transfection, 데이터 해석의 여러 단계는 이러한 분석의 성공적인 실행에 매우 중요합니다. 리포터 기질을 생성하기 위해 표준 분자 생물학 기법이 사용되지만, 겔 전기영동으로 공정을 시각화하면 transfection 전에 기질의 최고 품질과 순도를 보장할 수 있습니다. 이러한 분석은 일시적인 transfection에 의존하기 때문에 이러한 방법에 대한 일반적인 고려 사항이 적용됩니다. 여기에는 seeding 밀도, transfection 조건(시약 및 DNA 수량 포함) 최적화, forward 및 reverse transfection 형식의 적합성 평가가 포함됩니다. 이러한 리포터 분석은 다양한 전기천공법 및 지방추출 프로토콜로 성공적으로 수행되었으며, 이러한 분석을 수행하기 전에 옵션을 완전히 탐색해야 합니다. 또한 NanoLuc 신호(리포터 기판)를 Firefly 신호(대조군)로 정규화하여 파생된 복합 복구 신호뿐만 아니라 구성 요소인 NanoLuc 및 Firefly 신호를 검사하는 데 주의를 기울여야 합니다. 아티팩트는 Firefly 신호의 변화에 의해 구동되는 비율에서 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 매우 특이적인 화합물을 사용하여 용량-반응 모드에서 억제를 평가하면 반딧불 신호를 교란하지 않고 적정 가능한 방식으로 NanoLuc 신호를 억제해야 하며, 이는 안정적으로 유지되어야 합니다(그림 4G,H). 그러나 Firefly 신호가 교란되는 경우에도 Firefly 신호가 영향을 받지 않는 투여 창을 식별하여 수리에 대한 유용한 영향을 결정할 수 있습니다(그림 5).
가장 자주 사용되는 DSBR 리포터 분석과 비교할 때 이러한 염색체 외 발광 기반 리포터 분석에는 몇 가지 뚜렷한 장점이 있습니다. DSBR 경로가 매우 보존되어 있기 때문에 세포 모델마다 세포 메커니즘이 다르더라도 분석은 여전히 DSBR 숙련도 및 경로 선택에 대해 보고할 수 있습니다. 이는 최적의 과도 transfection 조건이 사전에 확립되어 있는 한 사용자가 관심 있는 모든 모델에 대해 DSBR을 평가할 수 있도록 합니다.
나노루시페라아제를 리포터 유전자로 사용하면 DSBR 리포터 분석에서 전통적으로 사용되어 온 형광 옵션에 비해 이점이 있습니다. NanoLuc은 빠르게 성숙하며 플레이트 리더8을 사용하여 고감도로 발광을 감지합니다. 기질 복구 속도(리포터 기질이 바로 수리 가능한 DSB 말단이 있는 세포로 transfection됨)와 결합된 이 형식의 DSBR 리포터 분석은 산업용 약물 발견 캐스케이드의 일부로 소분자를 스크리닝하는 데 필요한 빠른 처리 시간과 정량적 견고성에 이상적입니다. 실제로, 우리는 최근에 Polθ 중합효소 도메인13의 소분자 억제제의 식별에 사용되는 디스커버리 캐스케이드에서 절제-독립적 MMEJ 리포터 분석의 구현에 대해 설명했습니다.
또한 DSBR의 유전적 및 약리학적 섭동에 대한 특정 질문을 해결하기 위해 리포터 분석을 유연하게 구현할 수 있습니다(그림 3). 예를 들어, 리포터 기질의 transfection에 앞서, 세포는 48-72시간 동안 관심 유전자에 대해 siRNA로 transfection할 수 있습니다. 대안적으로, DSBR 경로에 대한 유전자 과발현의 영향은 리포터 기질의 transfection보다 24-48시간 전에 plasmid transfection을 수행하여 테스트할 수 있습니다. 약리학 연구의 경우, 본 프로토콜은 이미 소분자의 사용을 표준 워크플로우에 통합할 수 있는 방법을 설명하고 있지만, 대체 형식에는 사전 배양 또는 세척과 같은 화합물 처리 체제의 변경이 포함될 수 있습니다.
transient transfection의 확장성은 또한 스크리닝 전에 reporter substrate의 batch transfection을 수행하는 대규모 스크리닝 접근법을 지원할 수 있습니다. 또한, transfection에서 판독까지의 분석 기간도 다양할 수 있습니다. 표준 지속 시간은 16-24시간일 수 있지만 일부 분석은 6시간7 이내에 판독될 수 있습니다. 세포 생존력을 손상시킬 수 있는 작은 분자 또는 siRNA의 독성에 대한 우려도 분석 기간을 결정할 때 고려해야 합니다.
요약하면, 이 연구에서 요약되고 최근 간행물7 에 자세히 설명된 분석법은 세포 DSBR 숙련도에 대한 빠르고 강력한 평가를 제공합니다. 이 성분은 매우 민감하고 적정이 가능하여 유전자 및 약리학적 연구에 모두 적용할 수 있습니다. 결정적으로, 리포터 기질은 일시적인 transfection에 의해 세포에 도입될 수 있기 때문에, 염색체 DSBR 리포터의 경우와 같이 안정적인 통합에 의해 특정 세포주에 국한되지 않고 관심 있는 모든 transfectable 세포 모델에서 활용될 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 이러한 리포터 염색체 외 분석의 뚜렷한 한계는 게놈으로의 통합 부족으로 인해 DNA 복구의 생리학적, 염색질 맥락과 관련 조절 단서 및 조정을 완전히 요약하지 못할 수 있다는 것입니다15. 이를 위해 염색체 외 리포터 분석은 기존 DSBR 평가 방법을 보완하고 기초 연구와 약물 발견 모두에 적합한 리소스 툴킷을 확장합니다.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
모든 작업은 Artios Pharma Ltd.에서 자금을 지원했으며, 그림 1 과 그림 3 은 Biorender.com 로 제작되었습니다.
Materials
| 10x TBE buffer | Thermo Fisher | AM9863 | |
| 20% TBE-acrylamide gel | Invitrogen | EC6315BOX | |
| 50x TAE buffer | Fisher Scientific | BP13321 | |
| 6x Gel Loading Dye, Purple | NEB | B7024S | |
| 96-well white plate (with transparent bottom and lid) | Porvair | 204012 | |
| Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | For bead-based purification of DNA |
| Antarctic phosphatase and 10X buffer | NEB | M0289L | |
| CLARIOstar | BMG Labtech | 430-101 | Plate reader |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Cell counter |
| Custom oligonucleotides | Sigma-Aldrich | Custom order | For resection-independent MMEJ substrate. See Table 2. |
| D300e | Tecan | 30100152 | DMSO-based compound dispenser |
| D300e D4+ cassette | Tecan | 30097371 | High volume cassette for D300e compound dispenser |
| D300e T8+ cassette | Tecan | 30097370 | Low volume cassette for D300e compound dispenser |
| Dimethyl sulfoxide, cell culture grade | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehicle for compounds, used in Figure 4 and Figure 5 |
| DSBR reporter source plasmids | Artios | Available to the academic community upon request | |
| EcoRV-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3195M | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.365 | |
| Foetal Bovine Serum | PAN-Biotech | P30-3031 | |
| GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder | Thermo Fisher | SM1211 | Low molecular weight DNA ladder |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | Example cell line used in protocol |
| HindIII-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3104M | |
| HyClone Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | 10275262 | |
| I-SceI and 10x Tango Buffer | Invitrogen | ER1771 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.33 | |
| JetPRIME reagent and buffer | PolyPlus | 114-15 | Lipid-based transfection reagent |
| MegaStar 1.6 | VWR | 521-1749 | Centrifuge for 15 or 50 mL tubes |
| MEM Eagle | PAN-Biotech | P04-08056 | Culture medium for HEK-293 cells |
| Microplate shaker | Fisherbrand | 15504070 | Microplate orbital shaker |
| MicroStar 17R | VWR | 521-1647 | Centrifuge for 1.5 or 2 mL tubes |
| MultiDrop | Thermo Fisher | 5840300 | Cell or water-based reagent dispenser |
| MultiDrop Standard Cassette | Thermo Fisher | 24072670 | Cassette for MultiDrop reagent dispenser |
| NanoDLR Stop & Glo Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Reporter luciferase (NanoLuc) reagent to quench Firefly luminescence and detect NanoLuc luminescence. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
| ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Control luciferase (Firefly) assay reagent to detect Firefly. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
| PBS (without calcium or magnesium) | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| pGL4 Firefly plasmid (or similar) | Promega | E1310 (or equivalent) | Firefly control plasmid |
| pNL1.1 NanoLuc plasmid (or similar) | Promega | N1091 (or equivalent) | NanoLuc control plasmid, for adjustment of equipment settings/optimisation experiments |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| Quick-Load Purple 1 kb DNA Ladder | NEB | N0552S | High molecular weight DNA ladder |
| Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 | Thermo Fisher | AM9740 | For pH adjustment during gel extraction with QIAquick Gel Extraction Kit |
| SYBR Gold (10,000x) | Invitrogen | S11494 | For visualisation of ssDNA and dsDNA |
| SYBR Safe (10,000x) | Invitrogen | S33102 | For visualisation of dsDNA only |
| T4 DNA Ligase and 10x Ligase buffer | NEB | M0202L | |
| Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | For measurement of viability during cell counting |
| Trypsin-EDTA solution; 0.25% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| XhoI and 10x CutSmart buffer | NEB | R0146M |
Referencias
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